La tinción de Gram ( tinción de Gram o método de Gram ), es un método de tinción utilizado para clasificar las especies bacterianas en dos grandes grupos: bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas . También se puede utilizar para diagnosticar una infección por hongos . [1] El nombre proviene del bacteriólogo danés Hans Christian Gram , quien desarrolló la técnica en 1884. [2]
La tinción de Gram diferencia las bacterias por las propiedades químicas y físicas de sus paredes celulares . Las células grampositivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano en la pared celular que retiene el tinte primario, el cristal violeta . Las células gramnegativas tienen una capa de peptidoglicano más delgada que permite que el cristal violeta se lave al agregar etanol . Se tiñen de rosa o rojo con la contratinción , [3] comúnmente safranina o fucsina . La solución de yodo de Lugol siempre se añade después de la adición de cristal violeta para fortalecer los enlaces del tinte con la membrana celular .
La tinción de Gram es casi siempre el primer paso en la identificación de un grupo bacteriano. Si bien la tinción de Gram es una herramienta de diagnóstico valiosa tanto en entornos clínicos como de investigación, no todas las bacterias pueden clasificarse definitivamente mediante esta técnica. Esto da lugar a grupos gramvariables y gramindeterminados .
El método lleva el nombre de su inventor, el científico danés Hans Christian Gram (1853-1938), quien desarrolló la técnica mientras trabajaba con Carl Friedländer en la morgue del hospital de la ciudad de Berlín en 1884. Gram ideó su técnica no con el propósito de distinguir un tipo de bacteria de otro, sino hacer que las bacterias sean más visibles en secciones teñidas de tejido pulmonar. [4] Publicó su método en 1884 e incluyó en su breve informe la observación de que el bacilo del tifus no retenía la mancha. [5]
La tinción de Gram es una técnica de laboratorio bacteriológico [6] que se utiliza para diferenciar especies bacterianas en dos grandes grupos ( grampositivas y gramnegativas ) en función de las propiedades físicas de sus paredes celulares . [7] [ página necesaria ] La tinción de Gram también se puede utilizar para diagnosticar una infección por hongos . [1] La tinción de Gram no se utiliza para clasificar las arqueas , ya que estos microorganismos producen respuestas muy variables que no siguen sus grupos filogenéticos . [8]
Algunos organismos son gramvariables (lo que significa que pueden teñirse de forma negativa o positiva); algunos no se tiñen con ninguno de los tintes utilizados en la técnica de Gram y no se ven.
Las tinciones de Gram se realizan en fluidos corporales o una biopsia cuando se sospecha una infección . Las tinciones de Gram producen resultados mucho más rápidamente que los cultivos y son especialmente importantes cuando la infección marcaría una diferencia importante en el tratamiento y el pronóstico del paciente; ejemplos son el líquido cefalorraquídeo para la meningitis y el líquido sinovial para la artritis séptica . [9] [10]
Las bacterias grampositivas tienen una pared celular gruesa similar a una malla hecha de peptidoglicano (50-90% de la envoltura celular) y, como resultado, se tiñen de color púrpura con el cristal violeta, mientras que las bacterias gramnegativas tienen una capa más delgada (10% de la envoltura celular). sobre), por lo que no retienen la mancha morada y se tiñen de rosa con safranina. Hay cuatro pasos básicos de la tinción de Gram:
El cristal violeta (CV) se disocia en soluciones acuosas en CV+
y cloruro ( Cl−
) iones. Estos iones penetran la pared celular tanto de las células grampositivas como de las gramnegativas. El CV+
El ion interactúa con componentes cargados negativamente de las células bacterianas y tiñe las células de color púrpura. [13]
Yoduro ( yo−
o yo−
3) interactúa con CV+
y forma grandes complejos de cristal violeta y yodo (CV-I) dentro de las capas internas y externas de la célula. A menudo se hace referencia al yodo como mordiente , pero es un agente atrapador que impide la eliminación del complejo CV-I y, por tanto, colorea la célula. [14]
Cuando se añade un decolorante como el alcohol o la acetona, interactúa con los lípidos de la membrana celular. [15] Una célula gramnegativa pierde su membrana externa de lipopolisacárido y la capa interna de peptidoglicano queda expuesta. Los complejos CV-I se lavan de la célula gramnegativa junto con la membrana externa. [16] Por el contrario, una célula grampositiva se deshidrata debido a un tratamiento con etanol. Los grandes complejos CV-I quedan atrapados dentro de la célula grampositiva debido a la naturaleza multicapa de su peptidoglicano. [16] El paso de decoloración es fundamental y debe sincronizarse correctamente; La tinción violeta cristal se elimina tanto de las células grampositivas como de las negativas si el agente decolorante se deja actuar demasiado tiempo (cuestión de segundos). [17]
Después de la decoloración, la célula grampositiva permanece de color púrpura y la célula gramnegativa pierde su color púrpura. [17] La contratinción, que generalmente es safranina cargada positivamente o fucsina básica, se aplica en último lugar para dar a las bacterias gramnegativas decoloradas un color rosado o rojo. [3] [18] Tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas captan la contratinción. Sin embargo, la contratinción no se ve en bacterias grampositivas debido a la tinción violeta cristal más oscura.
Las bacterias grampositivas generalmente tienen una sola membrana ( monodermo ) rodeada por un peptidoglicano espeso. Esta regla la siguen dos filos: Bacillota (excepto las clases Mollicutes y Negativicutes ) y Actinomycetota . [7] [19] Por el contrario, los miembros de Chloroflexota (bacterias verdes sin azufre) son monodermos pero poseen un peptidoglicano delgado o ausente (clase Dehalococcoidetes ) y pueden teñirse de forma negativa, positiva o indeterminada; Los miembros de Deinococcota se tiñen positivamente, pero son didermos con un peptidoglicano espeso. [7] [ página necesaria ] [19]
Históricamente , las formas grampositivas formaban el filo Firmicutes , nombre que ahora se utiliza para el grupo más grande. Incluye muchos géneros conocidos como Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus y Clostridium . [20] También se ha ampliado para incluir Mollicutes, bacterias como Mycoplasma y Thermoplasma que carecen de paredes celulares y, por lo tanto, no pueden teñirse con Gram, pero se derivan de tales formas. [21]
Algunas bacterias tienen paredes celulares que son particularmente hábiles para retener manchas. Aparecerán positivas en la tinción de Gram aunque no estén estrechamente relacionadas con otras bacterias grampositivas. Estas se denominan bacterias acidorresistentes y solo pueden diferenciarse de otras bacterias grampositivas mediante procedimientos de tinción especiales . [22]
Las bacterias gramnegativas generalmente poseen una fina capa de peptidoglicano entre dos membranas ( diderm ). [23] El lipopolisacárido (LPS) es el antígeno más abundante en la superficie celular de la mayoría de las bacterias gramnegativas y contribuye hasta el 80% de la membrana externa de E. coli y Salmonella . [24] La mayoría de los filos bacterianos son gramnegativos, incluidas las cianobacterias , las bacterias verdes del azufre y la mayoría de los Pseudomonadota (las excepciones son algunos miembros de Rickettsiales y los insectos endosimbiontes de Enterobacteriales ). [7] [ página necesaria ] [19]
Algunas bacterias, después de teñirse con la tinción de Gram, producen un patrón gramvariable: se observa una mezcla de células rosadas y violetas. [16] [25] En cultivos de Bacillus, Butyrivibrio y Clostridium , una disminución en el espesor del peptidoglicano durante el crecimiento coincide con un aumento en el número de células que se tiñen gramnegativas. [25] Además, en todas las bacterias teñidas con la tinción de Gram, la edad del cultivo puede influir en los resultados de la tinción. [25]
Las bacterias Gram indeterminadas no responden de manera predecible a la tinción de Gram y, por lo tanto, no pueden determinarse como grampositivas o gramnegativas. Los ejemplos incluyen muchas especies de Mycobacterium , incluyendo Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis , los dos últimos de los cuales son los agentes causantes de la lepra y la tuberculosis, respectivamente. [26] [27] Las bacterias del género Mycoplasma carecen de una pared celular alrededor de sus membranas celulares , [9] lo que significa que no se tiñen mediante el método de Gram y son resistentes a los antibióticos que se dirigen a la síntesis de la pared celular. [28] [29]
El término tinción de Gram se deriva del apellido de Hans Christian Gram ; Por lo tanto, el epónimo (Gram) se escribe con mayúscula, pero no el nombre común (mancha), como es habitual en los términos científicos. [30] Las letras iniciales de grampositivo y gramnegativo , que son adjetivos epónimos , pueden ser G mayúscula o g minúscula , dependiendo de qué guía de estilo (si corresponde) rige el documento que se está escribiendo. El estilo en minúsculas lo utilizan los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. y otros regímenes de estilo como el estilo AMA . [31] Los diccionarios pueden utilizar minúsculas, [32] [33] mayúsculas, [34] [35] [36] [37] o ambas. [38] [39] El uso de mayúsculas grampositivas o gramnegativas también es común en muchos artículos y publicaciones de revistas científicas . [39] [40] [41] Cuando los artículos se envían a revistas, cada revista puede o no aplicar el estilo propio a la versión postimpresa . Las versiones preimpresas contienen cualquier estilo que utilizó el autor. Incluso los regímenes de estilo que utilizan minúsculas para los adjetivos grampositivos y gramnegativos todavía suelen utilizar mayúsculas para la tinción de Gram .
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