En los campos de la histología , la patología y la biología celular , la fijación es la preservación de los tejidos biológicos de la descomposición debida a la autólisis o la putrefacción . Detiene cualquier reacción bioquímica en curso y también puede aumentar la resistencia mecánica o la estabilidad de los tejidos tratados. La fijación del tejido es un paso crítico en la preparación de secciones histológicas, siendo su objetivo amplio preservar las células y los componentes del tejido y hacerlo de tal manera que permita la preparación de secciones delgadas teñidas. Esto permite la investigación de la estructura de los tejidos, que está determinada por las formas y tamaños de macromoléculas (dentro y alrededor de las células) como proteínas y ácidos nucleicos .
Al desempeñar su función protectora, los fijadores desnaturalizan las proteínas mediante coagulación, formando compuestos aditivos o mediante una combinación de procesos de coagulación y aditivos. Un compuesto que se agrega químicamente a macromoléculas estabiliza la estructura de manera más efectiva si es capaz de combinarse con partes de dos macromoléculas diferentes, un efecto conocido como entrecruzamiento. La fijación del tejido se realiza por varias razones. Una razón es matar el tejido para evitar la descomposición post mortem (autólisis y putrefacción). [1] La fijación preserva el material biológico ( tejido o células ) lo más cerca posible de su estado natural en el proceso de preparación del tejido para su examen. Para lograrlo, normalmente se deben cumplir varias condiciones.
En primer lugar, un fijador suele actuar para desactivar las biomoléculas intrínsecas, en particular las enzimas proteolíticas , que de otro modo digerirían o dañarían la muestra.
En segundo lugar, un fijador normalmente protege una muestra del daño extrínseco. Los fijadores son tóxicos para la mayoría de los microorganismos comunes ( bacterias en particular) que podrían existir en una muestra de tejido o que de otro modo podrían colonizar el tejido fijado. Además, muchos fijadores alteran químicamente el material fijado para hacerlo menos apetecible (ya sea indigerible o tóxico) para los microorganismos oportunistas.
Por último, los fijadores suelen alterar las células o los tejidos a nivel molecular para aumentar su resistencia mecánica o su estabilidad. Este aumento de resistencia y rigidez puede ayudar a preservar la morfología (forma y estructura) de la muestra a medida que se procesa para análisis posteriores.
Incluso la fijación más cuidadosa altera la muestra e introduce artefactos que pueden interferir con la interpretación de la ultraestructura celular. Un ejemplo destacado es el mesosoma bacteriano , que en la década de 1970 se pensaba que era un orgánulo de las bacterias grampositivas , pero que más tarde se demostró mediante nuevas técnicas desarrolladas para la microscopía electrónica que era simplemente un artefacto de fijación química. [2] [3] La estandarización de la fijación y otros procedimientos de procesamiento de tejidos tiene en cuenta esta introducción de artefactos, al establecer qué procedimientos introducen qué tipos de artefactos. Los investigadores que saben qué tipos de artefactos esperar con cada tipo de tejido y técnica de procesamiento pueden interpretar con precisión las secciones con artefactos o elegir técnicas que minimicen los artefactos en áreas de interés.
La fijación suele ser la primera etapa de un proceso de varios pasos para preparar una muestra de material biológico para microscopía u otro análisis. Por lo tanto, la elección del fijador y del protocolo de fijación puede depender de los pasos de procesamiento adicionales y de los análisis finales que se planifiquen. Por ejemplo, la inmunohistoquímica utiliza anticuerpos que se unen a una proteína objetivo específica. La fijación prolongada puede enmascarar químicamente estos objetivos y evitar la unión de anticuerpos. En estos casos, normalmente se utiliza un método de "solución rápida" que utiliza formalina fría durante aproximadamente 24 horas. También se puede utilizar metanol (100%) para una fijación rápida, y ese tiempo puede variar según el material biológico. Por ejemplo, las células de cáncer de mama humano MDA-MB 231 se pueden fijar durante sólo 3 minutos con metanol frío (-20 °C). Para los estudios de localización de enzimas, los tejidos deben prefijarse ligeramente o postfijarse después de que se haya formado el producto de actividad enzimática.
Generalmente existen tres tipos de procesos de fijación dependiendo de la muestra que se necesita fijar.
La fijación por calor se utiliza para la fijación de organismos unicelulares, más comúnmente bacterias y arqueas . Los organismos normalmente se mezclan con agua o solución salina fisiológica, lo que ayuda a distribuir uniformemente la muestra. Una vez diluida, la muestra se extiende sobre un portaobjetos de microscopio . Esta muestra de bacterias diluida se denomina comúnmente frotis después de colocarse en un portaobjetos. Después de que un frotis se haya secado a temperatura ambiente, se agarra el portaobjetos con unas pinzas o una pinza para ropa y se pasa a través de la llama de un mechero Bunsen varias veces para matar con calor y adherir el organismo al portaobjetos. También se puede utilizar un dispositivo microincinerador . Después del calentamiento, las muestras generalmente se tiñen y luego se obtienen imágenes con un microscopio. [4] La fijación por calor generalmente preserva la morfología general pero no las estructuras internas. El calor desnaturaliza la enzima proteolítica y previene la autólisis. La fijación por calor no se puede utilizar en el método de tinción capsular ya que la fijación por calor encogerá o destruirá la cápsula ( glucocáliz ) y no se podrá ver en las tinciones. [5]
La inmersión se puede utilizar para fijar muestras histológicas de una sola célula a un organismo completo. La muestra de tejido se sumerge en una solución fijadora durante un período de tiempo determinado. La solución fijadora debe tener un volumen al menos 10 veces mayor que el volumen del tejido. [6] Para que la fijación sea exitosa, el fijador debe difundirse por todo el tejido, por lo que se debe considerar el tamaño y la densidad del tejido, así como el tipo de fijador. Esta es una técnica común para aplicaciones celulares, pero también se puede utilizar para tejidos más grandes. Usar una muestra más grande significa que debe permanecer sumergida por más tiempo para que el fijador llegue al tejido más profundo. [7]
La perfusión es el paso de líquido a través de los vasos sanguíneos o canales naturales de un órgano u organismo. En la fijación de tejido mediante perfusión, el fijador se bombea al sistema circulatorio, generalmente a través de una aguja insertada en el ventrículo izquierdo . Esto se puede hacer mediante guía ecográfica o abriendo la cavidad torácica del sujeto. [8] El fijador se inyecta en el corazón con un volumen de inyección que coincide con el gasto cardíaco típico. Utilizando el sistema circulatorio innato, el fijador se distribuye por todo el cuerpo y el tejido no muere hasta que se fija. Cuando se utiliza este método, también se debe agregar un puerto de drenaje en algún lugar del sistema circulatorio para tener en cuenta la adición del volumen del fijador y el tampón; esto generalmente se hace en la aurícula derecha . El fijador se bombea al sistema circulatorio hasta que haya reemplazado toda la sangre. El uso de la perfusión tiene la ventaja de preservar la morfología, [9] pero las desventajas son que el sujeto muere y el volumen de fijador necesario para organismos más grandes es alto, lo que potencialmente aumenta los costos. Es posible disminuir el volumen de líquido necesario para realizar una fijación de perfusión pellizcando las arterias que alimentan tejidos que no son de interés para la investigación en cuestión. La fijación por perfusión se usa comúnmente para obtener imágenes de los tejidos del cerebro, los pulmones y los riñones en roedores, y también se usa para realizar autopsias en humanos. [7] [10]
Tanto en los procesos de fijación por inmersión como por perfusión, se utilizan fijadores químicos para preservar las estructuras en un estado (tanto química como estructuralmente) lo más cercano posible al tejido vivo. Esto requiere un fijador químico.
Los fijadores reticulantes actúan creando enlaces químicos covalentes entre proteínas en el tejido. Esto ancla las proteínas solubles al citoesqueleto y aporta rigidez adicional al tejido. La preservación de la estructura citoesquelética fina o transitoria, como las contracciones durante las ondas de diferenciación embrionaria, se logra mejor mediante un tratamiento previo con microondas antes de agregar un fijador de reticulación. [11] [12]
El fijador más utilizado en histología es el formaldehído . Generalmente se utiliza como formalina tamponada neutra (NBF) al 10%, es decir, aprox. 3,7 %–4,0 % de formaldehído en tampón fosfato, pH 7. Dado que el formaldehído es un gas a temperatura ambiente, se utiliza formalina (gas formaldehído disuelto en agua (~37 % p/v)) para preparar el primer fijador. El formaldehído fija el tejido entrecruzando las proteínas, principalmente los residuos del aminoácido básico lisina . Sus efectos son reversibles por exceso de agua y evita la pigmentación con formalina. El paraformaldehído también se usa comúnmente y se despolimeriza nuevamente a formalina cuando se calienta, lo que también lo convierte en un fijador eficaz. Otros beneficios del paraformaldehído incluyen el almacenamiento a largo plazo y una buena penetración en los tejidos. Es particularmente bueno para técnicas de inmunohistoquímica. El vapor de formaldehído también se puede utilizar como fijador para frotis celulares.
Otro aldehído popular para la fijación es el glutaraldehído . Funciona de manera similar al formaldehído, provocando la deformación de las hélices α de las proteínas. Sin embargo, el glutaraldehído es una molécula más grande que el formaldehído y, por lo tanto, penetra las membranas más lentamente. En consecuencia, la fijación de glutaraldehído en muestras de tejido más gruesas puede resultar difícil; Esto puede solucionarse reduciendo el tamaño de la muestra de tejido. Una de las ventajas de la fijación con glutaraldehído es que puede ofrecer un producto fijo más rígido o estrechamente vinculado: su mayor longitud y sus dos grupos aldehído le permiten "unir" y unir pares más distantes de moléculas de proteínas. Provoca cambios rápidos e irreversibles, es muy adecuado para microscopía electrónica, funciona bien a 4 °C y proporciona el mejor detalle general citoplasmático y nuclear. Sin embargo, no es ideal para la tinción inmunohistoquímica.
Algunos protocolos de fijación requieren una combinación de formaldehído y glutaraldehído para que sus respectivas fortalezas se complementen.
Estos fijadores reticulantes, especialmente el formaldehído, tienden a preservar la estructura secundaria de las proteínas y también pueden preservar la mayor parte de la estructura terciaria .
Los fijadores precipitantes (o desnaturalizantes ) actúan reduciendo la solubilidad de las moléculas de proteínas y, a menudo, interrumpiendo las interacciones hidrofóbicas que dan a muchas proteínas su estructura terciaria. La precipitación y agregación de proteínas es un proceso muy diferente del entrecruzamiento que ocurre con los fijadores de aldehído.
Los fijadores precipitantes más comunes son el etanol y el metanol . Se utilizan comúnmente para reparar frotis y secciones congeladas. También se utiliza acetona y se ha demostrado que produce una mejor conservación histológica que las secciones congeladas cuando se emplea en la técnica de acetona metilbenzoato xileno (AMEX).
El metanol, el etanol y la acetona, que desnaturalizan proteínas, rara vez se utilizan solos para fijar bloques, a menos que se estudien ácidos nucleicos.
El ácido acético es un desnaturalizante que a veces se usa en combinación con otros fijadores precipitantes, como el AFA de Davidson. [13] Se sabe que los alcoholes, por sí solos, causan una contracción y endurecimiento considerables del tejido durante la fijación, mientras que el ácido acético solo se asocia con la inflamación del tejido; la combinación de los dos puede dar como resultado una mejor preservación de la morfología del tejido .
Los fijadores oxidantes pueden reaccionar con las cadenas laterales de proteínas y otras biomoléculas, permitiendo la formación de enlaces cruzados que estabilizan la estructura del tejido. Sin embargo, causan una desnaturalización extensa a pesar de preservar la estructura celular fina y se utilizan principalmente como fijadores secundarios.
El tetróxido de osmio se utiliza a menudo como fijador secundario cuando se preparan muestras para microscopía electrónica . (No se utiliza para microscopía óptica ya que penetra muy mal en secciones gruesas de tejido).
El dicromato de potasio , el ácido crómico y el permanganato de potasio encuentran uso en ciertas preparaciones histológicas específicas.
Los mercuriales como el B-5 y el fijador de Zenker tienen un mecanismo desconocido que aumenta el brillo de la tinción y proporciona un excelente detalle nuclear. A pesar de ser rápidos, los mercuriales penetran poco y producen encogimiento de los tejidos. Su mejor aplicación es la fijación de tejidos hematopoyéticos y reticuloendoteliales. También tenga en cuenta que, dado que contienen mercurio, se debe tener cuidado al eliminarlos.
Los picratos penetran bien en el tejido para reaccionar con histonas y proteínas básicas para formar picratos cristalinos con aminoácidos y precipitar todas las proteínas. Es un buen fijador del tejido conectivo, conserva bien el glucógeno y extrae lípidos para dar resultados superiores al formaldehído en la inmunotinción de hormonas biogénicas y polipeptídicas. Sin embargo, provoca una pérdida de basófilos a menos que la muestra se lave minuciosamente después de la fijación.
El efecto de protección de disolventes orgánicos mediado por tampón de ácido hepes-glutámico (HOPE) proporciona una morfología similar a la formalina, una excelente conservación de antígenos proteicos para inmunohistoquímica e histoquímica enzimática, buenos rendimientos de ARN y ADN y ausencia de proteínas entrecruzadas.