La fototaxis y la fotoorientación de microalgas se han estudiado durante más de cien años en muchos laboratorios de todo el mundo. En 1980, Ken Foster desarrolló la primera teoría consistente sobre la funcionalidad de los ojos de las algas. [3] También analizó los espectros de acción publicados y complementó las células ciegas con retina y análogos de retina, lo que llevó a la conclusión de que el fotorreceptor para las respuestas de motilidad en Chlorophyceae es la rodopsina . [4]
Las fotocorrientes de Chlorophyceae Haematococcus pluvialis y Chlamydomonas reinhardtii se estudiaron durante muchos años en los grupos de Oleg Sineshchekov y Peter Hegemann . [5] [6] Basado en espectroscopía de acción y registros simultáneos de fotocorrientes y latidos flagelares, se determinó que las corrientes de los fotorreceptores y los movimientos flagelares posteriores están mediados por la rodopsina y controlan la fototaxis y las respuestas fotofóbicas. El aumento extremadamente rápido de la corriente del fotorreceptor después de un breve destello de luz llevó a la conclusión de que la rodopsina y el canal están íntimamente unidos en un complejo proteico, o incluso dentro de una sola proteína. [7] [8]
El nombre "canalrodopsina" se acuñó para resaltar esta propiedad inusual y las secuencias fueron renombradas en consecuencia. Las secuencias de nucleótidos de las rodopsinas ahora llamadas canalrodopsinas ChR1 y ChR2 finalmente se descubrieron en un proyecto de secuenciación EST a gran escala en C. reinhardtii . El envío independiente de las mismas secuencias a GenBank por parte de tres grupos de investigación generó confusión sobre su denominación: los nombres cop-3 y cop-4 fueron utilizados para el envío inicial por el grupo de Hegemann; [9] csoA y csoB por el grupo de Spudich; [2] y acop-1 y acop-2 del grupo de Takahashi. [10] Se descubrió que ambas secuencias funcionan como canales catiónicos activados por luz de un solo componente en ovocitos de Xenopus y células de riñón humano (HEK). [1] [11]
Sus funciones en la generación de corrientes de fotorreceptores en células de algas fueron caracterizadas por Oleg Sineshchekov, Kwang-Hwan Jung y John Spudich, [2] y Peter Berthold y Peter Hegemann. [12]
El ChR2 natural ("tipo salvaje") absorbe la luz azul con un espectro de absorción y acción máximo de 480 nm. [14] Cuando el complejo todo- trans -retinal absorbe un fotón , induce un cambio conformacional de todo- trans a 13- cis -retinal. Este cambio introduce uno más en la proteína transmembrana, abriendo el poro al menos 6 Å. En milisegundos, la retina se relaja y vuelve a su forma totalmente trans, cerrando el poro y deteniendo el flujo de iones. [11] La mayoría de las canalrodopsinas naturales son canales catiónicos no específicos (CCR) que conducen iones H + , Na + , K + y Ca 2+ . Se analizaron estructuralmente las canalrodopsinas conductoras de aniones (ACR) [15] y las canalrodpsinas selectivas de potasio (HcKCR1, HcKCR2) [16] para comprender su selectividad iónica. [17] [18] Se han utilizado ACR y KCR para inhibir la actividad neuronal. Las canalrodopsinas virales (VCR1) descubiertas recientemente se localizan en la membrana del retículo endoplasmático y provocan la liberación de calcio cuando se iluminan. [19]
El desarrollo como herramienta molecular.
En 2005, tres grupos establecieron secuencialmente ChR2 como una herramienta para el control remoto óptico ( optogenética ) genéticamente dirigido de neuronas , circuitos neuronales y comportamiento.
Al principio, el laboratorio de Karl Deisseroth demostró que ChR2 podría implementarse para controlar neuronas de mamíferos in vitro , logrando una precisión temporal del orden de milisegundos (tanto en términos de retraso de los picos como en términos de fluctuación temporal). [20] Porque todas las opsinas requieren retina como cofactor de detección de luz y no estaba claro si las células nerviosas centrales de los mamíferos contendrían suficientes niveles de retina, pero los contienen. También mostró, a pesar de la pequeña conductancia de un solo canal, potencia suficiente para impulsar las neuronas de los mamíferos por encima del umbral del potencial de acción. A partir de esto, la canalrodopsina se convirtió en la primera herramienta optogenética, con la que se podía controlar la actividad neuronal con la precisión temporal con la que operan las neuronas (milisegundos). Posteriormente se publicó un segundo estudio que confirma la capacidad de ChR2 para controlar la actividad de las neuronas de los vertebrados , en ese momento en la médula espinal de los pollos. [21] Este estudio fue el primero en el que ChR2 se expresó junto con un silenciador óptico, rodopsina -4 de vertebrados en este caso, lo que demuestra por primera vez que las células excitables se pueden activar y silenciar usando estas dos herramientas simultáneamente, iluminando el tejido en diferentes longitudes de onda. .
Se demostró que ChR2, si se expresa en neuronas o células musculares específicas, puede evocar comportamientos predecibles, es decir, puede controlar el sistema nervioso de un animal intacto, en este caso el invertebrado C. elegans . [22] Este fue el primero en utilizar ChR2 para dirigir el comportamiento de un animal en un experimento optogenético, sometiendo un tipo de célula genéticamente especificado a control remoto óptico. Aunque ambos aspectos habían sido ilustrados a principios de ese año por el grupo de Gero Miesenböck , desplegando el canal iónico indirectamente activado por luz P2X2, [23] en adelante fueron las opsinas microbianas como la canalrodopsina las que dominaron el campo del control remoto genéticamente dirigido de células excitables, debido a a la potencia, velocidad, capacidad de orientación, facilidad de uso y precisión temporal de la activación óptica directa, que no requiere ningún compuesto químico externo como ligandos enjaulados. [24]
Para superar sus principales desventajas: la pequeña conductancia de un solo canal (especialmente en estado estacionario), la limitación a una longitud de onda de excitación óptima (~470 nm, azul), así como el tiempo de recuperación relativamente largo, que no permite la activación controlada de las neuronas superiores. 20–40 Hz: ChR2 se ha optimizado mediante ingeniería genética . Una mutación puntual H134R (que intercambia el aminoácido histidina en la posición 134 de la proteína nativa por una arginina) resultó en un aumento de la conductancia en estado estacionario, como se describe en un artículo de 2005 que también estableció ChR2 como una herramienta optogenética en C. elegans . [22] En 2009, el laboratorio de Roger Tsien optimizó ChR2 para aumentar aún más la conductancia en estado estacionario y redujo drásticamente la desensibilización mediante la creación de quimeras de ChR1 y ChR2 y la mutación de aminoácidos específicos, produciendo ChEF y ChIEF, que permitieron la conducción de trenes de Potenciales de acción de hasta 100 Hz. [25] [26] En 2010, los grupos de Hegemann y Deisseroth introdujeron una mutación E123T en ChR2 nativo, produciendo ChETA, que tiene una cinética de encendido y apagado más rápida , lo que permite el control de potenciales de acción individuales en frecuencias de hasta 200 Hz ( en tipos de células apropiados). [27] [25]
Los grupos de Hegemann y Deisseroth también descubrieron que la introducción de la mutación puntual C128S convierte al derivado de ChR2 resultante en una herramienta de función escalonada: una vez "encendido" por la luz azul, ChR2(C128S) permanece en estado abierto hasta que se enciende. apagado por luz amarilla, una modificación que deteriora la precisión temporal, pero aumenta la sensibilidad a la luz en dos órdenes de magnitud. [28] También descubrieron y caracterizaron VChR1 en el alga multicelular Volvox carteri . VChR1 produce solo fotocorrientes diminutas, pero con un espectro de absorción desplazado al rojo en relación con ChR2. [29] Utilizando partes de la secuencia ChR1, la amplitud de la fotocorriente se mejoró posteriormente para permitir la excitación de dos poblaciones neuronales en dos longitudes de onda distintas. [30]
El grupo de Deisseroth ha sido pionero en muchas aplicaciones en animales vivos, como el control remoto genéticamente dirigido en roedores in vivo , [31] la inducción optogenética del aprendizaje en roedores, [32] el tratamiento experimental de la enfermedad de Parkinson en ratas, [33] [34] y la combinación con fMRI (opto-fMRI). [35] Otros laboratorios han sido pioneros en la combinación de estimulación de ChR2 con imágenes de calcio para experimentos totalmente ópticos, [36] mapeo de circuitos neuronales de largo alcance [37] y locales [38] , expresión de ChR2 desde un locus transgénico, directamente [39 ] o en el paradigma condicional Cre-lox [38] – así como la excitación de dos fotones de ChR2, que permite la activación de células individuales. [40] [41] [42]
En marzo de 2013, el Premio Cerebro (Premio Europeo Grete Lundbeck a la Investigación del Cerebro) fue otorgado conjuntamente a Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck y Nagel por "su invención y perfeccionamiento de la optogenética". [43] El mismo año, Hegemann y Nagel recibieron el Premio Louis-Jeantet de Medicina por "el descubrimiento de la canalrodopsina". En 2015, Boyden y Deisseroth recibieron el Premio Breakthrough en Ciencias de la Vida y en 2020, Miesenböck, Hegemann y Nagel recibieron el Premio Shaw en Ciencias de la Vida y Medicina por el desarrollo de la optogenética.
Rodopsinas de canal de diseñador
Las canalrodopsinas son herramientas clave en optogenética . El extremo C-terminal de la canalrodopsina-2 se extiende hacia el espacio intracelular y puede ser reemplazado por proteínas fluorescentes sin afectar la función del canal. Este tipo de construcción de fusión puede ser útil para visualizar la morfología de las células que expresan ChR2, es decir, indicar simultáneamente qué células están marcadas con FP y permitir que la canalrodopsina controle la actividad. [20] [36] Se ha demostrado que las mutaciones puntuales cercanas a la bolsa de unión de la retina afectan las propiedades biofísicas de la canalrodopsina, lo que da como resultado una variedad de herramientas diferentes.
Cinética
El cierre del canal después de la activación óptica se puede retrasar sustancialmente mutando los residuos proteicos C128 o D156. Esta modificación da como resultado canalrodopsinas supersensibles que pueden abrirse mediante un pulso de luz azul y cerrarse mediante un pulso de luz verde o amarillo (opsinas de función escalonada). [28] [44] [30] La mutación del residuo E123 acelera la cinética del canal (ChETA), y los mutantes ChR2 resultantes se han utilizado para estimular neuronas a hasta 200 Hz. [27] En general, las canalrodopsinas con cinética lenta son más sensibles a la luz a nivel de población, ya que los canales abiertos se acumulan con el tiempo incluso con niveles bajos de luz.
Amplitud de fotocorriente
Los mutantes H134R y T159C muestran fotocorrientes aumentadas, y una combinación de T159 y E123 (ET/TC) tiene fotocorrientes ligeramente más grandes y una cinética ligeramente más rápida que el ChR2 de tipo salvaje. [45] ChIEF, una quimera y un mutante puntual de ChR1 y ChR2, demuestra grandes fotocorrientes, poca desensibilización y una cinética similar a la de ChR2 de tipo salvaje. [25] Las variantes con tiempo abierto extendido (ChR2-XXL) producen fotocorrientes extremadamente grandes y son muy sensibles a la luz a nivel de población. [46]
Longitud de onda
Las canalrodopsinas quiméricas se han desarrollado combinando hélices transmembrana de ChR1 y VChR1, lo que lleva al desarrollo de ChR con desplazamientos espectrales al rojo (como C1V1 y ReaChR). [30] [47] ReaChR ha mejorado el tráfico de membranas y una fuerte expresión en células de mamíferos, y se ha utilizado para la activación transcraneal mínimamente invasiva de motoneuronas del tronco encefálico . Las búsquedas de secuencias homólogas en otros organismos han dado como resultado canalrodpsinas desplazadas al rojo más potentes y espectralmente mejoradas (Chrimson). [48] En combinación con ChR2, estas canalrodopsinas sensibles a la luz amarilla/roja permiten controlar dos poblaciones de neuronas de forma independiente con pulsos de luz de diferentes colores. [49] [50]
Se ha descubierto una canalrodopsina desplazada hacia el azul en el alga Scherffelia dubia . Después de algo de ingeniería para mejorar el tráfico y la velocidad de la membrana, la herramienta resultante (CheRiff) produjo grandes fotocorrientes con una excitación de 460 nm. [51] Se ha combinado con el indicador de calcio codificado genéticamente jRCaMP1b [52] en un sistema totalmente óptico llamado OptoCaMP. [53]
Selectividad iónica
La mayoría de las canalrodopsinas son canales catiónicos inespecíficos. Cuando se expresan en las neuronas, conducen principalmente iones Na + y, por tanto, son despolarizantes (excitadores). Se han diseñado variantes con permeabilidad al calcio de moderada a alta (CatCh, CapChRs). [54] [55] Recientemente se descubrieron canalrodopsinas específicas de K + (KCR, WiChR) en varios protistas . [56] [57] Cuando se expresan en neuronas, las canalrodopsinas selectivas de potasio hiperpolarizan la membrana tras la iluminación, evitando la generación de picos (inhibición).
La mutación de E90 al aminoácido arginina cargado positivamente convierte la canalrodopsina de un canal catiónico inespecífico a un canal conductor de cloruro (ChloC). [58] La selectividad por Cl- se mejoró aún más al reemplazar los residuos cargados negativamente en el poro del canal, lo que hizo que el potencial de inversión fuera más negativo. [59] [60] Las canalrodopsinas conductoras de aniones (iChloC, iC++, Gt ACR) inhiben los picos neuronales en cultivos celulares y en animales intactos cuando se iluminan con luz azul. Se han diseñado canalrodopsinas selectivas de calcio para activar enzimas dependientes de calcio en las células. [61]
Aplicaciones
Las canalrodopsinas se pueden expresar fácilmente en células excitables, como neuronas, utilizando una variedad de técnicas de transfección ( transfección viral , electroporación , pistola genética ) o animales transgénicos . El pigmento retiniano , que absorbe la luz , está presente en la mayoría de las células (de los vertebrados ) como vitamina A , lo que permite fotoestimular las neuronas sin añadir ningún compuesto químico. Antes del descubrimiento de las canalrodopsinas, los neurocientíficos se limitaban a registrar la actividad de las neuronas en el cerebro y correlacionar esta actividad con el comportamiento. Esto no es suficiente para demostrar que la actividad neuronal registrada realmente causó ese comportamiento. El control de redes de células genéticamente modificadas con luz, un campo emergente conocido como optogenética , permite ahora a los investigadores explorar el vínculo causal entre la actividad de un grupo específico de neuronas y los eventos mentales , por ejemplo, la toma de decisiones . Se ha demostrado el control óptico del comportamiento en nematodos, moscas de la fruta, pez cebra y ratones. [62] [63] Recientemente, se han diseñado canalrodopsinas conductoras de cloruro y también se han encontrado en la naturaleza. [15] [58] Estas herramientas se pueden utilizar para silenciar neuronas en cultivos celulares y en animales vivos desviando la inhibición . [59] [60]
El uso de múltiples colores de luz amplía las posibilidades de los experimentos optogenéticos . El ChR2 sensible a la luz azul y la halorrodopsina de la bomba de cloruro activada por la luz amarilla permiten juntos la activación óptica de múltiples colores y el silenciamiento de la actividad neuronal. [64] [65] Otro par interesante es el canal de cloruro sensible a la luz azul Gt ACR2 [66] y el canal catiónico sensible a la luz roja Chrimson [67] que se han combinado en una sola proteína (BiPOLES) para el control bidireccional de la membrana. potencial. [68]
Utilizando ChR2 marcado con fluorescencia, se pueden identificar axones y sinapsis estimulados por luz . [36] Esto es útil para estudiar los eventos moleculares durante la inducción de la plasticidad sináptica . [69] [70] Las redes neuronales cultivadas transfectadas pueden estimularse para que realicen algunos comportamientos deseados para aplicaciones en robótica y control. [71] ChR2 también se ha utilizado para mapear conexiones de largo alcance de un lado del cerebro al otro, y para mapear la ubicación espacial de entradas en el árbol dendrítico de neuronas individuales. [37] [72]
En 2006, se informó que la transfección con canalrodopsina podría restaurar la vista en ratones ciegos. [73]
Las neuronas pueden tolerar la expresión de ChR durante mucho tiempo y varios laboratorios están probando la estimulación optogenética para resolver las necesidades médicas. En ratones ciegos, la función visual se puede restaurar parcialmente expresando ChR2 en las células internas de la retina. [74] [75] En 2021, ChR ChrimsonR, sensible a la luz roja, se administró viralmente a los ojos de un paciente humano que padecía degeneración de la retina ( retinitis pigmentosa ), lo que provocó una recuperación parcial de su visión. [76] [77] Se ha demostrado que los implantes cocleares ópticos funcionan bien en experimentos con animales y actualmente se encuentran en ensayos clínicos. [78] [79] [80] En el futuro, los ChR pueden encontrar aún más aplicaciones médicas, por ejemplo, para la estimulación cerebral profunda de pacientes con Parkinson o para controlar ciertas formas de epilepsia .
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enlaces externos
Centro de recursos de optogenética / laboratorio Deisseroth