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Microscopía de superresolución

La microscopía de súper resolución es una serie de técnicas en microscopía óptica que permiten que dichas imágenes tengan resoluciones más altas que las impuestas por el límite de difracción , [1] [2] que se debe a la difracción de la luz. [3] Las técnicas de imágenes de súper resolución se basan en el campo cercano (microscopía de efecto túnel de fotones [4] así como las que utilizan la superlente Pendry y la microscopía óptica de barrido de campo cercano ) o en el campo lejano . Entre las técnicas que se basan en este último están las que mejoran la resolución solo modestamente (hasta aproximadamente un factor de dos) más allá del límite de difracción, como la microscopía confocal con orificio cerrado o asistida por métodos computacionales como la deconvolución [5] o la reasignación de píxeles basada en detectores (por ejemplo, microscopía de re-escaneo, [6] reasignación de píxeles [7] ), el microscopio 4Pi y tecnologías de microscopía de iluminación estructurada como SIM [8] [9] y SMI .

Hay dos grupos principales de métodos de microscopía de súper resolución en el campo lejano que pueden mejorar la resolución en un factor mucho mayor: [10]

  1. Superresolución determinista: los emisores más utilizados en microscopía biológica, los fluoróforos , muestran una respuesta no lineal a la excitación, que puede aprovecharse para mejorar la resolución. Entre estos métodos se incluyen STED , GSD , RESOLFT y SSIM.
  2. Superresolución estocástica: la complejidad química de muchas fuentes de luz molecular les confiere un comportamiento temporal complejo, que puede utilizarse para hacer que varios fluoróforos cercanos emitan luz en momentos separados y, por lo tanto, se puedan resolver en el tiempo. Estos métodos incluyen imágenes de fluctuación óptica de superresolución (SOFI) y todos los métodos de localización de moléculas individuales (SMLM), como SPDM , SPDMphymod , PALM , FPALM, STORM y dSTORM.

El 8 de octubre de 2014, el Premio Nobel de Química fue otorgado a Eric Betzig , WE Moerner y Stefan Hell por "el desarrollo de la microscopía de fluorescencia de súper resolución ", que lleva " la microscopía óptica a la nanodimensión ". [11] [12] Las diferentes modalidades de microscopía de súper resolución están siendo adoptadas cada vez más por la comunidad de investigación biomédica, y estas técnicas se están convirtiendo en herramientas indispensables para comprender la función biológica a nivel molecular. [13]

Historia

En 1978, se habían desarrollado las primeras ideas teóricas para romper el límite de Abbe , que exigía utilizar un microscopio 4Pi como un microscopio de fluorescencia de escaneo láser confocal donde la luz se enfoca desde todos los lados a un foco común que se utiliza para escanear el objeto mediante una excitación "punto por punto" combinada con una detección "punto por punto". [14] Sin embargo, la publicación de 1978 [15] había llegado a una conclusión física incorrecta (es decir, un punto de luz puntual) y había pasado por alto por completo el aumento de la resolución axial como el beneficio real de agregar el otro lado del ángulo sólido. [16]

Parte de la siguiente información fue obtenida (con permiso) de una revisión de técnicas de microscopía de subdifracción en un blog de química. [17] [18]

En 1986, Okhonin patentó un microscopio óptico de súper resolución basado en emisión estimulada. [19]

Técnicas de superresolución

Microscopía de efecto túnel de fotones (PTM)[20]

Mejora local / ANSOM / nanoantenas ópticas

Microscopía de mapeo aleatorio óptico de campo cercano (NORM)

La microscopía de mapeo aleatorio óptico de campo cercano (NORM) es un método de adquisición óptica de campo cercano mediante un microscopio de campo lejano a través de la observación del movimiento browniano de nanopartículas en un líquido de inmersión. [21] [22]

NORM utiliza el escaneo de la superficie de un objeto mediante el movimiento aleatorio de nanopartículas. A través del microscopio, las nanopartículas se ven como puntos redondos simétricos. El ancho del punto es equivalente a la función de dispersión de puntos (~ 250 nm) y está definido por la resolución del microscopio. Las coordenadas laterales de la partícula dada se pueden evaluar con una precisión mucho mayor que la resolución del microscopio. Al recopilar la información de muchos fotogramas, se puede trazar un mapa de la distribución de la intensidad del campo cercano en todo el campo de visión del microscopio. En comparación con NSOM y ANSOM, este método no requiere ningún equipo especial para el posicionamiento de la punta y tiene un campo de visión y una profundidad de enfoque amplios. Debido a la gran cantidad de "sensores" de escaneo, se puede lograr la adquisición de imágenes en un tiempo más corto.

4Pi

Un microscopio 4Pi es un microscopio de fluorescencia de barrido láser con una resolución axial mejorada . El valor típico de 500–700 nm se puede mejorar a 100–150 nm, lo que corresponde a un punto focal casi esférico con un volumen 5–7 veces menor que el de la microscopía confocal estándar .

La mejora en la resolución se logra mediante el uso de dos lentes objetivos opuestos, ambos enfocados en la misma ubicación geométrica. Además, la diferencia en la longitud del recorrido óptico a través de cada uno de los dos lentes objetivos se minimiza cuidadosamente. De esta manera, las moléculas que residen en el área focal común de ambos objetivos se pueden iluminar de manera coherente desde ambos lados, y la luz reflejada o emitida se puede recolectar de manera coherente, es decir, es posible la superposición coherente de la luz emitida en el detector. El ángulo sólido que se utiliza para la iluminación y la detección aumenta y se acerca al caso ideal, donde la muestra se ilumina y se detecta desde todos los lados simultáneamente. [23] [24]

Hasta ahora, la mejor calidad en un microscopio 4Pi se ha alcanzado en conjunto con la microscopía STED en células fijas [25] y la microscopía RESOLFT con proteínas conmutables en células vivas. [26]

Microscopía de iluminación estructurada (SIM)

Comparación de la resolución obtenida mediante microscopía confocal de barrido láser (arriba) y microscopía de iluminación estructurada 3D (3D-SIM-Microscope, abajo). Se muestran detalles de una envoltura nuclear . Poros nucleares (anti-NPC) rojos, envoltura nuclear (anti- Lamin ) verdes, cromatina ( tinción DAPI ) azul. Barra de escala: 1 μm.

La microscopía de iluminación estructurada (SIM) mejora la resolución espacial mediante la recopilación de información del espacio de frecuencias fuera de la región observable. Este proceso se realiza en el espacio recíproco: la transformada de Fourier (FT) de una imagen SI contiene información adicional superpuesta de diferentes áreas del espacio recíproco; con varios fotogramas en los que la iluminación se desplaza en cierta fase , es posible separar y reconstruir computacionalmente la imagen FT, que tiene mucha más información de resolución. La FT inversa devuelve la imagen reconstruida a una imagen de superresolución.

La microscopía electrónica podría reemplazar a la microscopía electrónica como herramienta para algunos diagnósticos médicos, entre ellos, el diagnóstico de trastornos renales, [27] cáncer de riñón, [28] y enfermedades de la sangre. [29]

Aunque el término "microscopía de iluminación estructurada" fue acuñado por otros en años posteriores, Guerra (1995) publicó por primera vez resultados [30] en los que la luz modelada por una rejilla de paso de 50 nm iluminaba una segunda rejilla de paso de 50 nm, con las rejillas rotadas una con respecto a la otra en la cantidad angular necesaria para lograr la ampliación. Aunque la longitud de onda de iluminación era de 650 nm, la rejilla de 50 nm se resolvió fácilmente. Esto mostró una mejora de casi 5 veces sobre el límite de resolución de Abbe de 232 nm que debería haber sido el más pequeño obtenido para la apertura numérica y la longitud de onda utilizadas. En un desarrollo posterior de este trabajo, Guerra demostró que la topografía lateral superresuelta se logra mediante el desplazamiento de fase del campo evanescente. Varias patentes estadounidenses [31] fueron otorgadas a Guerra individualmente o con colegas, y asignadas a Polaroid Corporation . Dyer Energy Systems, Calimetrics Inc. y Nanoptek Corp. adquirieron licencias para esta tecnología para el uso de esta técnica de súper resolución en almacenamiento de datos ópticos y microscopía.

Iluminación modulada espacialmente (SMI)

SMI + TIRF de tejido ocular humano afectado por degeneración macular

Una implementación de la iluminación estructurada se conoce como iluminación modulada espacialmente (SMI). Al igual que la iluminación estructurada estándar, la técnica SMI modifica la función de dispersión de puntos (PSF) de un microscopio de una manera adecuada. Sin embargo, en este caso, "no se mejora la resolución óptica en sí"; [32] en cambio, se utiliza la iluminación estructurada para maximizar la precisión de las mediciones de distancia de objetos fluorescentes, para "permitir mediciones de tamaño en dimensiones moleculares de unas pocas decenas de nanómetros". [32]

El microscopio Vertico SMI logra una iluminación estructurada mediante el uso de uno o dos rayos láser opuestos que interfieren a lo largo del eje. El objeto que se está fotografiando se mueve luego en pasos de alta precisión a través del campo de ondas, o el propio campo de ondas se mueve en relación con el objeto mediante cambios de fase. Esto da como resultado una resolución de distancia y tamaño axial mejorada. [32] [33] [34]

La SMI se puede combinar con otras tecnologías de súper resolución, por ejemplo, con 3D LIMON o LSI- TIRF como un interferómetro de reflexión interna total con iluminación estructurada lateralmente (este último instrumento y técnica es esencialmente un microscopio de túnel de fotones con cambio de fase, que emplea un microscopio de luz de reflexión interna total con campo evanescente con cambio de fase (Guerra, 1996). [31] Esta técnica SMI permite adquirir imágenes ópticas de luz de distribuciones de autofluoróforos en secciones de tejido ocular humano con una resolución óptica sin igual anteriormente. El uso de tres longitudes de onda de excitación diferentes (488, 568 y 647 nm) permite recopilar información espectral sobre la señal de autofluorescencia. Esto se ha utilizado para examinar el tejido ocular humano afectado por degeneración macular . [35]

Biodetección

La biodetección es crucial para comprender las actividades de los componentes celulares en la biología celular. Los sensores codificados genéticamente han transformado este campo y, por lo general, constan de dos partes: el dominio de detección, que detecta la actividad o las interacciones celulares, y el dominio de notificación, que produce señales mensurables. Hay dos tipos principales de sensores: los sensores basados ​​en FRET que utilizan dos fluoróforos para una cuantificación precisa, pero con algunas limitaciones, y los biosensores de un solo fluoróforo que son más pequeños, más rápidos y permiten experimentos multiplexados, pero pueden tener desafíos para obtener valores absolutos y detectar la saturación de la respuesta. Se han utilizado varios métodos de microscopía, incluida la obtención de imágenes de fluctuación óptica de súper resolución, para cuantificar y monitorear las actividades biológicas en tiempo real. Los ejemplos incluyen la detección de calcio, pH y voltaje. Greenwald et al. ofrecen una descripción general más completa de estas aplicaciones. [36]

Técnicas funcionales deterministas

La microscopía de Transiciones de Fluorescencia Óptica Saturable Reversible (RESOLFT) es una microscopía óptica con una resolución muy alta que puede obtener imágenes de detalles en muestras que no se pueden obtener con microscopía convencional o confocal . Dentro de RESOLFT se generalizan los principios de la microscopía STED [37] [38] y la microscopía GSD . Además, existen técnicas con otros conceptos además de RESOLFT o SSIM. Por ejemplo, la microscopía de fluorescencia que utiliza la propiedad de compuerta AND óptica del centro de nitrógeno-vacante [39] o la superresolución por Emisión Estimulada de Radiación Térmica (SETR), que utiliza las superlinealesidades intrínsecas de la radiación del Cuerpo Negro y expande el concepto de superresolución más allá de la microscopía. [40]

Agotamiento de emisiones estimulado (STED)

Mejora de la resolución entre la microscopía confocal tradicional y la microscopía STED.

La microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED) utiliza dos pulsos láser, el pulso de excitación para la excitación de los fluoróforos a su estado fluorescente y el pulso STED para la desexcitación de los fluoróforos por medio de la emisión estimulada . [19] [41] [42] [43] [44] [45] En la práctica, primero se aplica el pulso láser de excitación y luego sigue un pulso STED (también se utiliza STED sin pulsos utilizando láseres de onda continua). Además, el pulso STED se modifica de tal manera que presenta un punto de intensidad cero que coincide con el punto focal de excitación. Debido a la dependencia no lineal de la tasa de emisión estimulada en la intensidad del haz STED, todos los fluoróforos alrededor del punto focal de excitación estarán en su estado apagado (el estado fundamental de los fluoróforos). Al escanear este punto focal, se recupera la imagen. El ancho total a la mitad del máximo (FWHM) de la función de dispersión de puntos (PSF) del punto focal de excitación se puede comprimir teóricamente a un ancho arbitrario aumentando la intensidad del pulso STED, de acuerdo con la ecuación ( 1 ).

   ( 1 )
donde ∆r es la resolución lateral, ∆ es la FWHM de la PSF limitada por difracción, I max es la intensidad máxima del láser STED y es la intensidad umbral necesaria para lograr la reducción de la emisión saturada.

La principal desventaja de STED, que ha impedido su uso generalizado, es que la maquinaria es complicada. Por un lado, la velocidad de adquisición de imágenes es relativamente lenta para campos de visión grandes debido a la necesidad de escanear la muestra para recuperar una imagen. Por otro lado, puede ser muy rápida para campos de visión más pequeños: se han demostrado grabaciones de hasta 80 fotogramas por segundo. [46] [47] Debido a un gran valor de I s asociado con STED, existe la necesidad de un pulso de excitación de alta intensidad, que puede causar daño a la muestra.

Agotamiento del estado fundamental (GSD)

La microscopía de agotamiento del estado fundamental (microscopía GSD) utiliza el estado triplete de un fluoróforo como estado apagado y el estado singlete como estado encendido, por lo que se utiliza un láser de excitación para impulsar los fluoróforos en la periferia de la molécula en estado singlete al estado triplete. Esto es muy parecido a STED, donde el estado apagado es el estado fundamental de los fluoróforos, por lo que la ecuación ( 1 ) también se aplica en este caso. El valor es menor que en STED, lo que hace posible la obtención de imágenes de súper resolución con una intensidad láser mucho menor. Sin embargo, en comparación con STED, los fluoróforos utilizados en GSD son generalmente menos fotoestables; y la saturación del estado triplete puede ser más difícil de lograr. [48]

Microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM)

La microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM) aprovecha la dependencia no lineal de la tasa de emisión de fluoróforos con respecto a la intensidad del láser de excitación. [49] Al aplicar un patrón de iluminación sinusoidal [50] con una intensidad máxima cercana a la necesaria para saturar los fluoróforos en su estado fluorescente, se obtienen franjas de muaré. Las franjas contienen información espacial de alto orden que se puede extraer mediante técnicas computacionales. Una vez extraída la información, se recupera una imagen de súper resolución.

La técnica SSIM requiere cambiar el patrón de iluminación varias veces, lo que limita de manera efectiva la resolución temporal de la técnica. Además, se necesitan fluoróforos muy fotoestables debido a las condiciones de saturación, que provocan daño por radiación en la muestra y restringen las posibles aplicaciones para las que se puede utilizar la técnica SSIM.

Ejemplos de esta microscopía se muestran en la sección Microscopía de iluminación estructurada (SIM): imágenes de núcleos celulares y etapas mitóticas registradas con microscopía 3D-SIM.

Técnicas funcionales estocásticas

Microscopía de localización

La microscopía de localización de moléculas individuales (SMLM) resume todas las técnicas microscópicas que logran una súper resolución aislando emisores y ajustando sus imágenes con la función de dispersión de puntos (PSF). Normalmente, el ancho de la función de dispersión de puntos (~ 250 nm) limita la resolución. Sin embargo, dado un emisor aislado, uno puede determinar su ubicación con una precisión limitada solo por su intensidad de acuerdo con la ecuación ( 2 ). [51]

   ( 2 )
donde Δloc es la precisión de localización, Δ es el FWHM (ancho completo a la mitad del máximo) de la PSF y N es el número de fotones recolectados.

Este proceso de ajuste solo se puede realizar de manera confiable para emisores aislados (consulte Deconvolución ), y las muestras biológicas interesantes están tan densamente etiquetadas con emisores que el ajuste es imposible cuando todos los emisores están activos al mismo tiempo. Las técnicas SMLM resuelven este dilema activando solo un subconjunto disperso de emisores al mismo tiempo, localizando estos pocos emisores con mucha precisión, desactivándolos y activando otro subconjunto.

Teniendo en cuenta el fondo y la pixelación de la cámara, y utilizando la aproximación gaussiana para la función de dispersión de puntos ( disco de Airy ) de un microscopio típico, la resolución teórica es propuesta por Thompson et al. [52] y ajustada por Mortensen et al.: [53]

dónde
* σ es la desviación estándar gaussiana de las ubicaciones centrales de la misma molécula si se mide varias veces (por ejemplo, fotogramas de un video). (unidad m)
* σ PSF es la desviación estándar gaussiana de la función de dispersión de puntos, cuya FWHM según la ecuación de Ernst Abbe d = λ/(2 NA) . (unidad m)
* a es el tamaño de cada píxel de la imagen. (unidad m)
* N sig es el recuento de fotones de la PSF total sobre todos los píxeles de interés. (sin unidades)
* N bg es el conteo promedio de fotones de fondo por píxel (conteos oscuros ya eliminados), que se aproxima al cuadrado de la desviación estándar gaussiana del ruido de fondo de la distribución de Poisson de cada píxel a lo largo del tiempo o la desviación estándar de todos los píxeles con solo ruido de fondo, σ bg 2 . Cuanto mayor sea σ bg 2 , mejor será la aproximación (por ejemplo, buena para σ bg 2 >10, excelente para σ bg 2 >1000). (sin unidades)
* La resolución FWHM es ~2,355 veces la desviación estándar gaussiana .

Generalmente, la microscopía de localización se realiza con fluoróforos. Los fluoróforos adecuados (por ejemplo, para STORM) residen en un estado oscuro no fluorescente durante la mayor parte del tiempo y se activan de forma estocástica, normalmente con un láser de excitación de baja intensidad. Un láser de lectura estimula la fluorescencia y blanquea o fotoconmuta los fluoróforos de nuevo a un estado oscuro, normalmente en un plazo de 10 a 100 ms. En la acumulación de puntos para la obtención de imágenes en topografía a nanoescala (PAINT), los fluoróforos no son fluorescentes antes de unirse y después se vuelven fluorescentes. Los fotones emitidos durante la fase fluorescente se recogen con una cámara y la imagen resultante del fluoróforo (que está distorsionada por la PSF) se puede ajustar con una precisión muy alta, incluso del orden de unos pocos angstroms. [54] Repetir el proceso varios miles de veces garantiza que todos los fluoróforos puedan pasar por el estado brillante y se registren. A continuación, una computadora reconstruye una imagen con súper resolución.

Las características deseables de los fluoróforos utilizados para estos métodos, con el fin de maximizar la resolución, son que sean brillantes. Es decir, que tengan un coeficiente de extinción alto y un rendimiento cuántico alto . También deben poseer una alta relación de contraste (relación entre el número de fotones emitidos en el estado claro y el número de fotones emitidos en el estado oscuro). Además, es deseable una muestra densamente etiquetada, según los criterios de Nyquist .

La multitud de métodos de microscopía de localización difieren principalmente en el tipo de fluoróforos utilizados.

Microscopía de distancia de precisión espectral (SPDM)

Microscopía de súper resolución de una sola molécula de YFP / SPDMphymod

Una única y diminuta fuente de luz se puede localizar mucho mejor de lo que normalmente permite la resolución de un microscopio: aunque la luz producirá un punto borroso, se pueden utilizar algoritmos informáticos para calcular con precisión el centro del punto borroso, teniendo en cuenta la función de dispersión de puntos del microscopio, las propiedades de ruido del detector, etc. Sin embargo, este enfoque no funciona cuando hay demasiadas fuentes cercanas entre sí: entonces, todas las fuentes se difuminan juntas.

La microscopía de distancia de precisión espectral (SPDM) es una familia de técnicas de localización en microscopía de fluorescencia que soluciona el problema de la existencia de muchas fuentes midiendo solo unas pocas fuentes a la vez, de modo que cada fuente esté "ópticamente aislada" de las demás (es decir, separada por más de la resolución del microscopio, típicamente ~200-250 nm). [55] [56] [57] Este "aislamiento óptico" requiere que las partículas bajo examen tengan diferentes firmas espectrales, de modo que sea posible observar la luz de solo unas pocas moléculas a la vez utilizando las fuentes de luz y los filtros adecuados. Esto logra una resolución óptica efectiva varias veces mejor que la resolución óptica convencional que está representada por la mitad del ancho del máximo principal de la función de imagen puntual efectiva. [55]

La resolución estructural alcanzable mediante SPDM puede expresarse en términos de la distancia medible más pequeña entre dos partículas puntiformes de diferentes características espectrales ("resolución topológica"). El modelado ha demostrado que, en condiciones adecuadas en cuanto a precisión de localización, densidad de partículas, etc., la "resolución topológica" corresponde a una " frecuencia espacial " que, en términos de la definición clásica, es equivalente a una resolución óptica muy mejorada. Las moléculas también pueden distinguirse de formas aún más sutiles basándose en el tiempo de vida de la fluorescencia y otras técnicas. [55]

Una aplicación importante es la investigación genómica (estudio de la organización funcional del genoma ). Otro campo de aplicación importante es la investigación de la estructura de las membranas.

Modificador SPDMphy
Microscopía de localización de doble color SPDMphymod/microscopía de súper resolución con proteínas de fusión GFP y RFP

La microscopía de localización para muchos colorantes fluorescentes estándar como GFP , colorantes Alexa y moléculas de fluoresceína es posible si se dan ciertas condiciones fotofísicas. Con esta tecnología de fluoróforos físicamente modificables (SPDMphymod) , una única longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la nanoimágenes [58] en contraste con otras tecnologías de microscopía de localización que necesitan dos longitudes de onda láser cuando se utilizan moléculas de fluorescencia especiales fotoconmutables/fotoactivables. Otro ejemplo del uso de SPDMphymod es un análisis de partículas del virus del mosaico del tabaco (TMV) [59] o el estudio de la interacción virus-célula . [60] [61]

Basándose en las transiciones de estado singlete-triplete, es crucial para SPDMphymod que este proceso sea continuo y que lleve al efecto de que una sola molécula pase primero a un estado oscuro reversible de muy larga duración (con una vida media de hasta varios segundos) desde el que vuelve a un estado fluorescente que emite muchos fotones durante varios milisegundos antes de volver a un estado oscuro irreversible de muy larga duración. La microscopía SPDMphymod utiliza moléculas fluorescentes que emiten la misma frecuencia de luz espectral pero con diferentes firmas espectrales basadas en las características de destello. Al combinar dos mil imágenes de la misma célula, es posible, utilizando mediciones de precisión óptica láser, registrar imágenes de localización con una resolución óptica significativamente mejorada. [62]

Los colorantes fluorescentes estándar que ya se utilizan con éxito con la tecnología SPDMphymod son GFP , RFP , YFP , Alexa 488 , Alexa 568, Alexa 647, Cy2 , Cy3, Atto 488 y fluoresceína .

Localización óptica criogénica en 3D (COLD)

La localización óptica criogénica en tres dimensiones (COLD) permite determinar los cuatro sitios de unión de la biotina en la proteína estreptavidina.

La localización óptica criogénica en 3D (COLD) es un método que permite localizar múltiples sitios fluorescentes dentro de una única biomolécula de tamaño pequeño a mediano con una resolución de escala Angstrom. [54] La precisión de localización en este enfoque se mejora porque la fotoquímica más lenta a bajas temperaturas conduce a una mayor cantidad de fotones que pueden emitirse desde cada fluoróforo antes del fotoblanqueo. [63] [64] Como resultado, la microscopía de localización estocástica criogénica logra la resolución submolecular necesaria para resolver las posiciones 3D de varios fluoróforos unidos a una proteína pequeña. Al emplear algoritmos conocidos de la microscopía electrónica, las proyecciones 2D de los fluoróforos se reconstruyen en una configuración 3D. COLD lleva la microscopía de fluorescencia a su límite fundamental, dependiendo del tamaño de la etiqueta. El método también se puede combinar con otras técnicas de biología estructural (como cristalografía de rayos X, espectroscopia de resonancia magnética y microscopía electrónica) para proporcionar valiosa información complementaria y especificidad.

Microscopía de localización activada por unión (BALM)

fBALM Microscopía de localización de moléculas individuales de súper resolución mediante microscopía de localización activada por unión asistida por fluctuación de la estructura del ADN

La microscopía de localización activada por unión (BALM) es un concepto general para la microscopía de localización de moléculas individuales (SMLM): imágenes superresueltas de colorantes que se unen al ADN basadas en la modificación de las propiedades del ADN y de un colorante. [65] Mediante un ajuste cuidadoso del entorno químico, que conduce a la fusión reversible local del ADN y al control de la hibridación sobre la señal de fluorescencia, se pueden introducir moléculas de colorante que se unen al ADN. Los colorantes de ADN que se intercalan y se unen al surco menor se pueden utilizar para registrar y aislar ópticamente solo unas pocas señales de colorante que se unen al ADN a la vez. La BALM asistida por fluctuación de la estructura del ADN (fBALM) se ha utilizado para nanoescalar diferencias en la arquitectura nuclear, con una resolución estructural prevista de aproximadamente 50 nm. Imágenes de la nanoestructura de la cromatina con microscopía de localización activada por unión basada en fluctuaciones de la estructura del ADN. [66] Recientemente, la mejora significativa del rendimiento cuántico de fluorescencia de NIAD-4 al unirse a un amiloide se aprovechó para la obtención de imágenes BALM de fibrillas amiloides [67] y oligómeros. [68]

TORMENTA, PALMA y FPALMA

La microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), la microscopía de localización fotoactivada (PALM) y la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) son técnicas de obtención de imágenes de superresolución que utilizan la activación secuencial y la localización con resolución temporal de fluoróforos fotoconmutables para crear imágenes de alta resolución. Durante la obtención de imágenes, solo un subconjunto de fluoróforos ópticamente resolubles se activa a un estado fluorescente en un momento dado, de modo que la posición de cada fluoróforo se puede determinar con alta precisión al encontrar las posiciones del centroide de las imágenes de una sola molécula de un fluoróforo en particular. Posteriormente, se desactiva un subconjunto de fluoróforos y se activa y se obtiene la imagen de otro subconjunto. La iteración de este proceso permite localizar numerosos fluoróforos y construir una imagen de superresolución a partir de los datos de la imagen.

Estos tres métodos se publicaron de forma independiente en un corto período de tiempo y sus principios son idénticos. STORM se describió originalmente utilizando colorantes Cy5 y Cy3 unidos a ácidos nucleicos o proteínas, [69] mientras que PALM y FPALM se describieron utilizando proteínas fluorescentes fotoconmutables. [70] [71] En principio, se puede utilizar cualquier fluoróforo fotoconmutable y STORM se ha demostrado con una variedad de sondas y estrategias de etiquetado diferentes. Utilizando la fotoconmutación estocástica de fluoróforos individuales, como Cy5, [72] STORM se puede realizar con una única fuente de excitación láser roja. El láser rojo cambia el fluoróforo Cy5 a un estado oscuro mediante la formación de un aducto [73] [74] y posteriormente devuelve la molécula al estado fluorescente. También se han utilizado muchos otros colorantes con STORM. [75] [76] [77] [78] [79] [80]

Además de los fluoróforos individuales, con STORM se pueden utilizar pares de colorantes que consisten en un fluoróforo activador (como Alexa 405, Cy2 o Cy3) y un colorante reportero fotosensible (como Cy5, Alexa 647, Cy5.5 o Cy7). [69] [81] [82] En este esquema, el fluoróforo activador, cuando se excita cerca de su máximo de absorción, sirve para reactivar el colorante fotosensible al estado fluorescente. Se han realizado imágenes multicolor utilizando diferentes longitudes de onda de activación para distinguir pares de colorantes, dependiendo del fluoróforo activador utilizado, [81] [82] [83] o utilizando fluoróforos fotosensibles espectralmente distintos, ya sea con o sin fluoróforos activadores. [75] [84] [85] También se pueden utilizar proteínas fluorescentes fotosensibles. [70] [71] [85] [86] Se ha logrado un etiquetado altamente específico de estructuras biológicas con sondas fotoconmutables mediante tinción de anticuerpos, [81] [82] [83] [87] conjugación directa de proteínas, [88] y codificación genética. [70] [71] [85] [86]

STORM también se ha extendido a la obtención de imágenes tridimensionales mediante astigmatismo óptico, en el que la forma elíptica de la función de dispersión de puntos codifica las posiciones x, y y z para muestras de hasta varios micrómetros de espesor, [82] [87] y se ha demostrado en células vivas. [85] Hasta la fecha, la resolución espacial lograda por esta técnica es de ~20 nm en las dimensiones laterales y ~50 nm en la dimensión axial; y la resolución temporal es tan rápida como 0,1–0,33 s. [ cita requerida ]

Acumulación de puntos para la obtención de imágenes en topografía a nanoescala (PAINT)

La acumulación de puntos para la obtención de imágenes en topografía a nanoescala (PAINT) es un método de localización de moléculas individuales que logra una fluorescencia estocástica de moléculas individuales mediante adsorción/absorción molecular y fotoblanqueo/desorción. [89] [90] El primer colorante utilizado fue el rojo Nilo , que no es fluorescente en solución acuosa, pero sí fluorescente cuando se inserta en un entorno hidrófobo, como micelas o paredes celulares vivas. Por lo tanto, la concentración del colorante se mantiene pequeña, a nivel nanomolar, de modo que la tasa de sorción de la molécula al área limitada por difracción esté en la región de milisegundos. La unión estocástica de moléculas de un solo colorante (sondas) a un objetivo inmovilizado se puede resolver espacial y temporalmente bajo un microscopio de fluorescencia de campo amplio típico. Cada colorante se fotoblanquea para devolver el campo a un estado oscuro, de modo que el siguiente colorante pueda unirse y observarse. La ventaja de este método, en comparación con otros métodos estocásticos, es que además de obtener la imagen súper resuelta del objetivo fijo, puede medir la cinética de unión dinámica de las moléculas de sonda que se difunden, en solución, al objetivo. [91] [90]

Combinando la técnica de súper resolución 3D (por ejemplo, la función de dispersión de puntos de doble hélice desarrollada en el grupo de Moerner), colorantes fotoactivados, intermitencia activa dependiente de la potencia y acumulación de puntos para imágenes en topografía a nanoescala, SPRAIPAINT (SPRAI=Super resolución por intermitencia activa dependiente de la potencia [92] ) puede súper resolver las paredes de células vivas. [93] PAINT funciona manteniendo un equilibrio entre las tasas de adsorción/absorción del colorante y de fotoblanqueo/desorción. Este equilibrio se puede estimar con principios estadísticos. [94] La tasa de adsorción o absorción de un soluto diluido a una superficie o interfaz en una solución de gas o líquido se puede calcular utilizando las leyes de difusión de Fick . La tasa de fotoblanqueo/desorción se puede medir para una condición de solución dada y una densidad de potencia de iluminación.

El método DNA-PAINT se ha ampliado aún más para utilizar colorantes regulares, donde se utiliza la unión y desunión dinámica de una sonda de ADN marcada con colorante a un origami de ADN fijo para lograr imágenes estocásticas de una sola molécula. [95] [96] El método DNA-PAINT ya no se limita a colorantes sensibles al medio ambiente y puede medir tanto la cinética de adsorción como la de desorción de las sondas al objetivo. El método utiliza el efecto de desenfoque de la cámara de los colorantes en movimiento. Cuando un colorante regular se difunde en la solución, su imagen en una cámara CCD típica se ve borrosa debido a su velocidad relativamente rápida y al tiempo de exposición de la cámara relativamente largo, lo que contribuye al fondo de fluorescencia. Sin embargo, cuando se une a un objetivo fijo, el colorante deja de moverse; y se puede lograr una entrada clara en la función de dispersión de puntos.

El término para este método es mbPAINT ("mb" significa desenfoque de movimiento ). [97] Cuando se utiliza un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para la obtención de imágenes, la profundidad de excitación se limita a ~100 nm desde el sustrato, lo que reduce aún más el fondo de fluorescencia de los colorantes difuminados cerca del sustrato y el fondo en la solución a granel. Se pueden utilizar colorantes muy brillantes para mbPAINT, lo que proporciona resoluciones espaciales típicas de un solo cuadro de ~20 nm y resoluciones temporales cinéticas de una sola molécula de ~20 ms bajo intensidades de fotoexcitación relativamente suaves, lo que es útil para estudiar la separación molecular de proteínas individuales. [98]

La resolución temporal se ha mejorado aún más (20 veces) utilizando una máscara de fase rotacional colocada en el plano de Fourier durante la adquisición de datos y resolviendo la función de dispersión de puntos distorsionada que contiene información temporal. El método se denominó Super Temporal-Resolved Microscopy (STReM). [99]

Microscopía de localización sin etiquetas

Microscopía de localización sin etiquetas SPDM: la microscopía de súper resolución revela estructuras intracelulares previamente indetectables

Se puede lograr una resolución óptica de estructuras celulares en el rango de aproximadamente 50 nm, incluso en células sin etiquetas, utilizando microscopía de localización SPDM .

Al utilizar dos longitudes de onda láser diferentes, SPDM revela objetos celulares que no son detectables en condiciones convencionales de imágenes de fluorescencia de campo amplio, además de lograr una mejora sustancial en la resolución de las estructuras autofluorescentes.

Como control, las posiciones de los objetos detectados en la imagen de localización coinciden con las de la imagen de campo claro. [100]

También se ha demostrado la microscopía de superresolución sin etiquetas utilizando las fluctuaciones de una señal de dispersión Raman mejorada en la superficie sobre una metasuperficie plasmónica altamente uniforme. [101]

Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)

El método dSTORM utiliza la fotoconmutación de un único fluoróforo. En dSTORM, los fluoróforos se encuentran incrustados en un sistema de amortiguación reductor y oxidante (ROXS) y se excita la fluorescencia. A veces, de forma aleatoria, el fluoróforo entrará en un triplete o en algún otro estado oscuro que sea sensible al estado de oxidación del tampón, a partir del cual se puede hacer que emita fluorescencia, de modo que se puedan registrar las posiciones de moléculas individuales. [102] El desarrollo del método dSTORM se produjo en tres laboratorios independientes aproximadamente al mismo tiempo y también se lo denominó "microscopía de fotoblanqueo reversible" (RPM), [103] "microscopía de agotamiento del estado fundamental seguida de retorno de moléculas individuales" (GSDIM), [104] así como el nombre ahora generalmente aceptado de dSTORM. [105]

Software para microscopía de localización

La microscopía de localización depende en gran medida de un software que pueda ajustar con precisión la función de dispersión de puntos (PSF) a millones de imágenes de fluoróforos activos en unos pocos minutos. [106] Dado que los métodos de análisis clásicos y los paquetes de software utilizados en las ciencias naturales son demasiado lentos para resolver computacionalmente estos problemas, y a menudo requieren horas de computación para procesar datos medidos en minutos, se han desarrollado programas de software especializados. Muchos de estos paquetes de software de localización son de código abierto; se enumeran en SMLM Software Benchmark. [107] Una vez que se han determinado las posiciones de las moléculas, es necesario mostrar las ubicaciones y se han desarrollado varios algoritmos para la visualización. [108]

Imágenes de fluctuación óptica de súper resolución (SOFI)

Es posible evitar la necesidad de ajuste de PSF inherente a la microscopía de localización de moléculas individuales (SMLM) calculando directamente la autocorrelación temporal de los píxeles. Esta técnica se denomina imágenes de fluctuación óptica de superresolución (SOFI) y se ha demostrado que es más precisa que la SMLM cuando la densidad de fluoróforos activos simultáneamente es muy alta.

Microscopía de localización omnipresente (OLM)

La microscopía de localización omnipresente (OLM) es una extensión de las técnicas de microscopía de moléculas individuales (SMLM) que permiten obtener imágenes de moléculas individuales de alta densidad con una fuente de luz incoherente (como una lámpara de arco de mercurio) y una configuración de microscopio de epifluorescencia convencional. [109] Una breve ráfaga de excitación azul profundo (con un láser de 350-380 nm, en lugar de 405 nm) permite una reactivación prolongada de las moléculas, para una resolución de 90 nm en las muestras de prueba. Finalmente, se pueden realizar imágenes correlativas STED y SMLM en la misma muestra biológica utilizando un medio de imágenes simple, que puede proporcionar una base para una resolución aún mejor. Estos hallazgos pueden democratizar las imágenes de súper resolución y ayudar a cualquier científico a generar imágenes de moléculas individuales de alta densidad incluso con un presupuesto limitado.

Mejora de la resolución mediante imágenes secuenciales (RESI)

La mejora de la resolución mediante imágenes secuenciales (RESI) es una extensión de DNA-PAINT que puede lograr una resolución teóricamente ilimitada. [110] En lugar de utilizar un tipo de etiqueta para identificar una especie objetivo dada, las copias del mismo objetivo se etiquetan con secuencias de ADN ortogonales. Con imágenes secuenciales (es decir, separadas), las nubes de localización que se superpondrían en SMLM convencional se pueden (1) resolver y (2) combinar en una única "super" localización, cuya precisión se escala con el número subyacente de localizaciones. Como el número de localizaciones alcanzables en DNA-PAINT es ilimitado, también lo es la resolución teórica de RESI. La superposición de las localizaciones RESI de las rondas de imágenes subyacentes crea una imagen compuesta de alta resolución.

Combinación de técnicas

Microscopía de nanodimensionamiento con microscopio óptico 3D (LIMON)

Microscopía de súper resolución de color dual 3D con Her2 y Her3 en células mamarias, colorantes estándar: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

Las imágenes de microscopía nanométrica de microscopio óptico (3D LIMON), que se obtienen con el microscopio Vertico SMI , son posibles gracias a la combinación de SMI y SPDM, donde primero se aplica el proceso SMI y luego el SPDM.

El proceso SMI determina el centro de las partículas y su dispersión en la dirección del eje del microscopio. Si bien el centro de las partículas/moléculas se puede determinar con una precisión de 1 a 2 nm, la dispersión alrededor de este punto se puede determinar hasta un diámetro axial de aproximadamente 30 a 40 nm.

Posteriormente, se determina la posición lateral de la partícula/molécula individual mediante SPDM, logrando una precisión de unos pocos nanómetros. [111]

Como aplicación biológica en el modo de color dual 3D, se logró la disposición espacial de los grupos de Her2/neu y Her3 . Las posiciones en las tres direcciones de los grupos de proteínas se pudieron determinar con una precisión de aproximadamente 25 nm. [112]

Microscopía óptica y electrónica correlativa integrada

La combinación de un microscopio de superresolución con un microscopio electrónico permite visualizar información contextual, con el etiquetado proporcionado por marcadores de fluorescencia. Esto supera el problema del fondo negro que queda al investigador cuando se utiliza solo un microscopio óptico. En un sistema integrado, la muestra se mide con ambos microscopios simultáneamente. [113]

Mejora de técnicas que utilizan redes neuronales

Recientemente, debido a los avances en la computación de inteligencia artificial, se han utilizado redes neuronales de aprendizaje profundo ( GAN ) para mejorar la súper resolución de imágenes fotográficas extraídas de microscopios ópticos, [114] mejorando la resolución de 40x a 100x. [115] La resolución aumenta de 20x con un microscopio óptico a 1500x, comparable a un microscopio electrónico de barrido, a través de una lente neuronal. [116] Estas técnicas tienen aplicaciones en la súper resolución de imágenes de tomografía por emisión de positrones y microscopía de fluorescencia. [117]

Véase también

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