La enzima lactoilglutatión liasa (EC 4.4.1.5, también conocida como glioxalasa I ) cataliza la isomerización de aductos de hemitioacetal, que se forman en una reacción espontánea entre un grupo glutatión y aldehídos como el metilglioxal . [1] [2]
La glioxalasa I deriva su nombre de su catálisis del primer paso del sistema glioxalasa , un sistema crítico de desintoxicación de dos pasos para el metilglioxal . El metilglioxal se produce naturalmente como un subproducto de la bioquímica normal, pero es altamente tóxico debido a sus reacciones químicas con proteínas , ácidos nucleicos y otros componentes celulares. El segundo paso de desintoxicación, en el que ( R )-S - lactoilglutatión se divide en glutatión y D-lactato, lo lleva a cabo la glioxalasa II , una hidrolasa . Inusualmente, estas reacciones llevadas a cabo por el sistema glioxalasa no oxidan el glutatión, que suele actuar como una coenzima redox . Aunque la aldosa reductasa también puede desintoxicar el metilglioxal, el sistema de glioxalasa es más eficiente y parece ser la más importante de estas vías. La glioxalasa I es un objetivo atractivo para el desarrollo de fármacos para tratar infecciones por algunos protozoos parásitos y cáncer . Se han identificado varios inhibidores de la glioxalasa I, como el S-(N-hidroxi-N-metilcarbamoil)glutatión.
La glioxalasa I se clasifica como una liasa carbono-azufre aunque, estrictamente hablando, la enzima no forma ni rompe un enlace carbono-azufre. Más bien, la enzima desplaza dos átomos de hidrógeno de un átomo de carbono del metilglioxal al átomo de carbono adyacente. En efecto, la reacción es una reacción redox intramolecular; un carbono se oxida mientras que el otro se reduce. El mecanismo procede restando y luego añadiendo protones , formando un intermedio enediolato, en lugar de transferir hidruros . Inusualmente para una metaloproteína , esta enzima muestra actividad con varios metales diferentes. La glioxalasa I también es inusual porque es estereoespecífica en la segunda mitad de su mecanismo, pero no en la primera. Estructuralmente, la enzima es un dímero de dominio intercambiado en muchas especies, aunque las dos subunidades se han fusionado en un monómero en la levadura , mediante duplicación de genes .
El nombre sistemático de esta clase de enzimas es ( R )-S - lactoilglutatión metilglioxal-liasa (isomerizante; formadora de glutatión); otros nombres incluyen:
En algunos casos, la fracción glutatiónilo puede ser suministrada por tripanotiona , el análogo del glutatión en protozoos parásitos como los tripanosomas . El gen humano de esta enzima se llama GLO1 .
La lactoilglutatión liasa en humanos está codificada por el gen GLO1 . [7] [8] [9]
Se han solucionado varias estructuras de la glioxalasa I. Se han publicado cuatro estructuras de la forma humana, con los códigos de acceso PDB 1BH5, 1FRO, 1QIN y 1QIP. Se han publicado cinco estructuras de la forma Escherichia coli , con los códigos de acceso 1FA5, 1FA6, 1FA7, 1FA8 y 1F9Z. Finalmente, se ha resuelto una estructura de la versión específica de tripanotiona de Leishmania major , 2C21. En todos estos casos, la estructura cuaternaria de la unidad biológica es un dímero de dominio intercambiado, en el que el sitio activo y la estructura secundaria de lámina beta de 8 cadenas se forman a partir de ambas subunidades. Sin embargo, en levaduras como Saccharomyces cerevisiae , las dos subunidades se han fusionado en un único monómero de doble tamaño, mediante duplicación genética . Cada mitad del dímero estructural es un sándwich de 3 a 4 hélices alfa a ambos lados de una lámina beta antiparalela de 8 hebras; la interfaz del dímero se compone en gran medida del encuentro cara a cara de las dos hojas beta. [1]
Las estructuras terciaria y cuaternaria de la glioxalasa I son similares a las de varios otros tipos de proteínas. Por ejemplo, la glioxalasa I se asemeja a varias proteínas que permiten a las bacterias resistir antibióticos como la fosfomicina , la bleomicina y la mitomicina . Asimismo, las enzimas no relacionadas metilmalonil-CoA epimerasa , 3-desmetilubiquinona-9, 3-O-metiltransferasa y numerosas dioxigenasas como la bifenil-2,3-diol 1,2-dioxigenasa , catecol 2,3-dioxigenasa , 3,4-dihidroxifenilacetato La 2,3-dioxigenasa y la 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa se parecen a la glioxalasa I en su estructura. [1] Finalmente, muchas proteínas de función desconocida o incierta también se parecen a la glioxalasa I, como At5g48480 de la planta Arabidopsis thaliana .
El sitio activo tiene cuatro regiones principales.
La principal función fisiológica de la glioxalasa I es la desintoxicación del metilglioxal , un 2-oxoaldehído reactivo que es citostático en bajas concentraciones [10] y citotóxico en concentraciones milimolares. [11] El metilglioxal es un subproducto de la bioquímica normal que es carcinógeno, mutágeno [12] y puede dañar químicamente varios componentes de la célula, como proteínas y ácidos nucleicos. [11] [13] El metilglioxal se forma espontáneamente a partir de fosfato de dihidroxiacetona, enzimáticamente por triosafosfato isomerasa y metilglioxal sintasa, como también en el catabolismo de la treonina . [14]
Para minimizar la cantidad de metilglioxal tóxico y otros 2-oxoaldehídos reactivos, se ha desarrollado el sistema glioxalasa . El metilglioxal reacciona espontáneamente con el glutatión reducido (o su equivalente, tripanotiona ), [15] ) formando un hemitioacetal. El sistema glioxalasa convierte dichos compuestos en D- lactato y restablece el glutatión. [14] En esta conversión, los dos carbonos carbonílicos del 2-oxoaldehído se oxidan y reducen, respectivamente, oxidándose el aldehído a un ácido carboxílico y reduciéndose el grupo acetal a un alcohol. El sistema glioxalasa evolucionó muy temprano en la historia de la vida y se encuentra casi universalmente en todas las formas de vida.
El sistema glioxalasa consta de dos enzimas, glioxalasa I y glioxalasa II . La primera enzima, descrita aquí, reordena el hemitioacetal formado naturalmente por el ataque del glutatión al metilglioxal en el producto. La glioxalasa II hidroliza el producto para volver a formar el glutatión y producir D- lactato . Por tanto, el glutatión actúa inusualmente como coenzima y sólo se requiere en cantidades catalíticas (es decir, muy pequeñas); Normalmente, el glutatión actúa como un par redox en reacciones de oxidación-reducción.
También se ha sugerido que el sistema glioxalasa desempeña un papel en la regulación del crecimiento celular [16] y en el ensamblaje de microtúbulos . [17]
La glioxalasa I requiere iones metálicos unidos para la catálisis. [18] La enzima humana [19] y sus homólogos en la levadura ( Saccharomyces cerevisiae ) [20] y Pseudomonas putida [21] utilizan zinc divalente , Zn 2+ . Por el contrario, las versiones procarióticas suelen utilizar un ion níquel . La glioxalasa que encontré en parásitos tripanosómicos eucariotas como Leishmania major y Trypanosoma cruzi también puede utilizar níquel para su actividad, [15] posiblemente reflejando una adquisición de su gen GLO1 mediante transferencia genética horizontal . [22]
Una propiedad de la glioxalasa I es su falta de especificidad por el ion metálico catalítico. La mayoría de las enzimas se unen a un tipo particular de metal y su actividad catalítica depende de haberse unido a ese metal. Por ejemplo, las oxidorreductasas suelen utilizar un ion metálico específico como hierro , manganeso o cobre y no funcionarán si se reemplaza su ion metálico preferido, debido a diferencias en el potencial redox ; por tanto, la superóxido dismutasa ferrosa no puede funcionar si su hierro catalítico se reemplaza por manganeso, y viceversa. Por el contrario, aunque la glioxalasa I humana prefiere utilizar zinc divalente, es capaz de funcionar con muchos otros metales divalentes, incluidos magnesio , manganeso , cobalto , níquel e incluso calcio . [23] sin embargo, la enzima es inactiva con el catión ferroso. [24] De manera similar, aunque la glioxalasa I procariótica prefiere el níquel, es capaz de funcionar con cobalto, manganeso y cadmio ; sin embargo, la enzima es inerte con el zinc unido, debido a un cambio en la geometría de coordinación de octaédrica a trigonal bipiramidal . [15] Los estudios estructurales y computacionales han revelado que el metal se une a los dos oxígenos carbonílicos del resto metilglioxal en dos de sus sitios de coordinación, estabilizando el anión enediolato intermedio.
Otra propiedad inusual de la glioxalasa I es su estereoespecificidad inconsistente. El primer paso de su mecanismo de reacción (la abstracción del protón de C 1 y la posterior protonación de O 2 ) no es estereoespecífico y funciona igualmente bien independientemente de la quiralidad inicial en C 1 en el sustrato de hemitioacetal. El intermedio enediolato resultante es aquiral, pero el segundo paso del mecanismo de reacción (la abstracción de un protón del O 1 y la subsiguiente protonación de C 2 ) es definitivamente estereoespecífico y produce sólo la forma ( S ) de D-lactoilglutatión. Se cree que esto es el resultado de los dos glutamatos unidos de manera opuesta al ión metálico; cualquiera de los dos puede realizar el primer paso, pero sólo uno puede realizar el segundo paso. La razón de esta asimetría aún no está completamente determinada.
La molécula de metilglioxal consta de dos grupos carbonilo flanqueados por un átomo de hidrógeno y un grupo metilo . En la discusión siguiente, estos dos carbonos carbonilo se denominarán C1 y C2, respectivamente. Tanto en el sustrato de hemitioacetal como en el producto (R)-S-lactoilglutatión, el resto glutatión está unido al grupo carbonilo C1.
El mecanismo básico de la glioxalasa I es el siguiente. El sustrato hemitioacetal se forma cuando una molécula de glutatión , probablemente en su forma tiolato reactiva , ataca el carbonilo C1 del metilglioxal o un compuesto relacionado, haciendo que ese carbono sea tetravalente. Esta reacción ocurre de forma espontánea en la célula, sin la participación de la enzima. Este hemitioacetal luego es unido por la enzima, que desplaza el hidrógeno de C1 a C2. El carbonilo C2 se reduce a una forma de alcohol tetravalente mediante la adición de dos protones, mientras que el carbonilo C1 se restaura perdiendo hidrógeno mientras conserva su enlace con el resto glutatión.
Un estudio computacional, combinado con los datos experimentales disponibles, sugiere el siguiente mecanismo de resolución atómica para la glioxalasa I. [25] En el sitio activo, el metal catalítico adopta una geometría de coordinación octaédrica y, en ausencia de sustrato, se une a dos aguas, dos glutamatos opuestos , una histidina y otra de cadena lateral, normalmente otra histidina o glutamatos . Cuando el sustrato ingresa al sitio activo, las dos aguas se desprenden y los dos oxígenos carbonílicos del sustrato se unen directamente al ion metálico. Los dos glutamatos opuestos suman y restan protones de C1 y C2 y sus respectivos oxígenos, O1 y O2. La primera mitad de la reacción transfiere un protón de C1 a O2, mientras que la segunda mitad transfiere un protón de O1 a C2. La primera reacción puede ser llevada a cabo por cualquiera de los glutamatos opuestos, dependiendo de la quiralidad inicial de C1 en el sustrato hemitioacetal; sin embargo, la segunda mitad es estereoespecífica y la lleva a cabo sólo uno de los glutamatos opuestos.
Vale la pena señalar que el primer mecanismo teóricamente confirmado para el sustrato R de la glioxalasa se publicó recientemente. [26]
El mecanismo catalítico de la glioxalasa se ha estudiado mediante la teoría del funcional de la densidad, simulaciones de dinámica molecular y métodos híbridos QM/MM. La razón de la especial especificidad de la enzima (acepta ambos enantiómeros de su sustrato quiral pero los convierte en el mismo enantiómero del producto) es la mayor basicidad y flexibilidad de uno de los glutamatos del sitio activo (Glu172). [27] [28] [29]
Originalmente se creía que la glioxalasa I funcionaba mediante la transferencia de un hidruro , que es un protón rodeado por dos electrones (H – ). [30] En esto, se pensaba que se parecía al mecanismo clásico de reacción de Cannizzaro , en el que el ataque de un hidroxilato a un aldehído lo convierte en un anión de alcohol tetravalente; este anión dona sus hidrógenos a un segundo aldehído, formando un ácido carboxílico y un alcohol. (En efecto, dos aldehídos idénticos se reducen y oxidan entre sí, dejando el mismo estado de oxidación neto).
En la glioxalasa I, dicho mecanismo de transferencia de hidruro funcionaría de la siguiente manera. El ataque del glutatión dejaría un O cargado y el aldehído hidrógeno unido a C 1 . Si el oxígeno del carbonilo de C 2 puede obtener un hidrógeno de una cadena lateral ácida de la enzima, formando un alcohol, entonces el hidrógeno de C 1 podría deslizarse simultáneamente con sus electrones sobre C 2 (la transferencia de hidruro). Al mismo tiempo, el electrón extra en el oxígeno del C 1 podría reformar el doble enlace del carbonilo, dando así el producto final.
En la década de 1970 se propuso un mecanismo alternativo (y en última instancia correcto) que utilizaba la transferencia de protones (H + ). [31] En este mecanismo, una cadena lateral básica de la enzima extrae el protón aldehído del C 1 ; al mismo tiempo, el protón a se añade al oxígeno del C 2 , formando así un enediol . El ene significa que se ha formado un doble enlace entre C 2 y C 1 , a partir de los electrones dejados por la abstracción del protón aldehído; el diol se refiere a que a partir de los dos grupos carbonilo iniciales se han formado dos alcoholes. En este mecanismo, el intermedio forma el producto añadiendo otro protón al C 2 .
Se esperaba que los protones del disolvente contribuyeran a formar el producto a partir del intermedio enediol del mecanismo de transferencia de protones y cuando tales contribuciones no se observaron en agua tritiada , 3 H 1 O, se favoreció el mecanismo de transferencia de hidruro. Sin embargo, no se pudo descartar una hipótesis alternativa (que el sitio activo de la enzima estaba profundamente enterrado lejos del agua) y finalmente resultó ser correcta. Los primeros indicios llegaron cuando las temperaturas cada vez mayores mostraron una incorporación cada vez mayor de tritio, lo que es consistente con la transferencia de protones e inesperado con la transferencia de hidruros. La evidencia definitiva se puede obtener con estudios del efecto isotópico de hidrógeno-deuterio en sustratos fluorados en el grupo metilo y deuterados en el aldehído. El fluoruro es un buen grupo saliente; el mecanismo de transferencia de hidruro predice una menor eliminación de iones fluoruro con la muestra deuterada, mientras que el mecanismo de transferencia de protones predice más . Los experimentos con tres tipos de glioxalasa I (en forma de levadura, rata y ratón) respaldaron el mecanismo de transferencia de protones en todos los casos. [32] Este mecanismo finalmente se observó en las estructuras cristalinas de la glioxalasa I.
La expresión de Glo1 se correlaciona con diferencias en el comportamiento similar a la ansiedad en ratones [33] [34], así como con el comportamiento en la prueba de suspensión de la cola , que es sensible a los fármacos antidepresivos ; [35] sin embargo, la dirección de estos efectos no siempre ha sido consistente, lo que ha generado escepticismo. [36] Las diferencias en la expresión de Glo1 en ratones parecen ser causadas por una variante del número de copias que es común entre las cepas endogámicas de ratones. [37] Se ha propuesto que los efectos conductuales de Glo1 se deben a la actividad de su sustrato principal, el metilglioxal, en los receptores GABA A. [38] Se ha demostrado que una molécula pequeña inhibidora de la glioxalasa I tiene propiedades ansiolíticas, identificando así otra posible indicación para los inhibidores de la glioxalasa I. [38]
La glioxalasa I es un objetivo para el desarrollo de productos farmacéuticos contra bacterias, protozoos (especialmente Trypanosoma cruzi y Leishmania ) y cáncer humano. [39] Se han desarrollado numerosos inhibidores, la mayoría de los cuales comparten la fracción glutatión . Entre la familia de inhibidores que se unen más estrechamente a la enzima humana se encuentran los derivados de S -( N -aril- N- hidroxicarbamoil)glutatión, en particular el derivado de p -bromofenilo, que tiene una constante de disociación de 14 nM. [40] Se cree que el análogo más cercano al estado de transición es el S -( N -hidroxi- N - p- yodofenilcarbamoil)glutatión; la estructura cristalina de este compuesto unido a la enzima humana se ha resuelto con una resolución de 2 Å (código de acceso de PDB 1QIN). [41]
Los experimentos sugieren que el metilglioxal es preferentemente tóxico para las células en proliferación, como las del cáncer. [42]
Investigaciones recientes demuestran que la expresión de GLO1 está regulada positivamente en varios tumores malignos humanos, incluido el melanoma metastásico. [43] [44]
