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Ensayo

Un ensayo es un procedimiento de investigación (analítico) en medicina de laboratorio , minería , farmacología , biología ambiental y biología molecular para evaluar cualitativamente o medir cuantitativamente la presencia, cantidad o actividad funcional de una entidad objetivo. La entidad medida a menudo se denomina analito , mensurando o objetivo del ensayo. El analito puede ser un fármaco , una sustancia bioquímica , un elemento o compuesto químico , o una célula de un organismo o muestra orgánica . [1] [2] Un ensayo generalmente tiene como objetivo medir la propiedad intensiva de un analito y expresarla en la unidad de medida relevante (por ejemplo , molaridad , densidad , actividad funcional en unidades internacionales de enzima, grado de efecto en comparación con un estándar, etc.).

Si el ensayo involucra reactivos exógenos (los reactivos ), entonces sus cantidades se mantienen fijas (o en exceso) de modo que la cantidad y calidad del objetivo sean los únicos factores limitantes. La diferencia en el resultado del ensayo se utiliza para deducir la calidad o cantidad desconocida del objetivo en cuestión. Algunos ensayos (p. ej., ensayos bioquímicos) pueden ser similares al análisis químico y la titulación . Sin embargo, los ensayos normalmente involucran material biológico o fenómenos que son intrínsecamente más complejos en composición o comportamiento, o ambos. Por lo tanto, la lectura de un ensayo puede ser ruidosa e implicar mayores dificultades de interpretación que una valoración química precisa. Por otro lado, los ensayos cualitativos de generación anterior, especialmente los bioensayos , pueden ser mucho más generales y menos cuantitativos (por ejemplo, contar la muerte o disfunción de un organismo o células en una población, o algún cambio descriptivo en alguna parte del cuerpo de un grupo de animales). ).

Los ensayos se han convertido en una parte rutinaria de la tecnología médica , ambiental , farmacéutica y forense moderna . Otras empresas también pueden emplearlos a nivel industrial , en la acera o en el campo. Los ensayos con alta demanda comercial han sido bien investigados en sectores de investigación y desarrollo de industrias profesionales. También han pasado por generaciones de desarrollo y sofisticación. En algunos casos, están protegidos por normas de propiedad intelectual, como patentes concedidas por invenciones. Estos ensayos a escala industrial suelen realizarse en laboratorios bien equipados y con una organización automatizada del procedimiento, desde solicitar un ensayo hasta el procesamiento preanalítico de la muestra (recogida de muestras, manipulaciones necesarias, por ejemplo, centrifugado para la separación , división en alícuotas si es necesario, almacenamiento, recuperación, pipeteo , aspiración , etc.). Los analitos generalmente se prueban en analizadores automáticos de alto rendimiento , y los resultados se verifican y se devuelven automáticamente a los proveedores de servicios y usuarios finales que los solicitan . Esto es posible mediante el uso de un sistema informático de laboratorio avanzado que interactúa con múltiples terminales de computadora con los usuarios finales, servidores centrales , los instrumentos físicos del autoanalizador y otros autómatas. [ se necesita aclaración ]

Etimología

Según Etymology Online, [3] el verbo ensayo significa "intentar, esforzarse, esforzarse, probar la calidad de"; del anglofrancés assaier , de assai (sustantivo), del francés antiguo essai , "juicio". Así, el sustantivo ensayo significa "prueba, prueba de calidad, prueba de carácter" (de mediados del siglo XIV), del anglo-francés assai ; y su significado “análisis” es de finales del siglo XIV.

Para la valoración de monedas, esto significaba literalmente el análisis de la pureza del oro o la plata (o cualquiera que fuera el componente precioso) que representaba el verdadero valor de la moneda. Esto podría haberse traducido más tarde (posiblemente después del siglo XIV) en un uso más amplio de "análisis", [ cita necesaria ] por ejemplo, en farmacología, análisis de un componente importante de un objetivo dentro de una mezcla, como el ingrediente activo de un fármaco. dentro de los excipientes inertes en una formulación que anteriormente se medía sólo de forma grosera por su acción observable sobre un organismo (p. ej., una dosis letal o una dosis inhibidora).

Pasos generales

Un ensayo (análisis) nunca es un proceso aislado, ya que debe ir acompañado de procedimientos pre y posanalíticos. Tanto la orden de comunicación (la solicitud para realizar un ensayo más la información relacionada) como el manejo de la muestra en sí (la recolección, documentación, transporte y procesamiento realizado antes de comenzar el ensayo) son pasos preanalíticos. De manera similar, una vez completado el ensayo, los resultados deben documentarse, verificarse y comunicarse: los pasos posteriores al análisis. Como ocurre con cualquier sistema de transmisión y manejo de información de múltiples pasos , la variación y los errores al informar los resultados finales implican no solo aquellos intrínsecos al ensayo en sí sino también los que ocurren en los procedimientos preanalíticos y postanalíticos.

Si bien los pasos analíticos del ensayo en sí reciben mucha atención, [4] son ​​aquellos que reciben menos atención de la cadena de usuarios (los procedimientos preanalíticos y postanalíticos) los que normalmente acumulan la mayor cantidad de errores; por ejemplo, los pasos preanalíticos en los ensayos de laboratorio médico pueden contribuir entre el 32 y el 75% de todos los errores de laboratorio. [5]

Los ensayos pueden ser muy diversos, pero generalmente implican los siguientes pasos generales:

  1. Procesamiento y manipulación de muestras para presentar selectivamente el objetivo en una forma discernible o mensurable a un sistema de discriminación/identificación/detección. Podría implicar una simple separación centrífuga o lavado o filtración o captura mediante alguna forma de unión selectiva o incluso puede implicar modificar el objetivo, por ejemplo, recuperación de epítopos en ensayos inmunológicos o cortar el objetivo en pedazos, por ejemplo, en espectrometría de masas . Generalmente, se realizan varios pasos separados antes de un ensayo y se denominan procesamiento preanalítico. Pero algunas de las manipulaciones pueden ser parte inseparable del ensayo mismo y, por lo tanto, no se considerarán preanalíticas.
  2. Principio de discriminación/identificación de objetivos específicos : discriminar del fondo (ruido) de componentes similares e identificar específicamente un componente objetivo particular ("analito") en un material biológico por sus atributos específicos. (por ejemplo, en un ensayo de PCR , un cebador oligonucleotídico específico identifica la diana mediante emparejamiento de bases basándose en la secuencia de nucleótidos específica única de la diana).
  3. Sistema de amplificación de señal (u objetivo) : la presencia y cantidad de ese analito se convierte en una señal detectable que generalmente implica algún método de amplificación de señal, de modo que pueda discriminarse fácilmente del ruido y medirse, por ejemplo, en un ensayo de PCR entre una mezcla de Las secuencias de ADN solo el objetivo específico se amplifican en millones de copias mediante una enzima ADN polimerasa para que pueda discernirse como un componente más prominente en comparación con cualquier otro componente potencial. A veces, la concentración del analito es demasiado grande y, en ese caso, el ensayo puede implicar una dilución de la muestra o algún tipo de sistema de disminución de la señal que es una amplificación negativa.
  4. Sistema de detección (e interpretación) de señales : un sistema para descifrar la señal amplificada en una salida interpretable que puede ser cuantitativa o cualitativa. Pueden ser métodos visuales o manuales muy toscos o pueden ser detectores electrónicos digitales o analógicos muy sofisticados.
  5. La mejora de la señal y el filtrado de ruido se pueden realizar en cualquiera o en todos los pasos anteriores. Dado que cuanto más posterior sea un paso/proceso durante un ensayo, mayor será la posibilidad de transmitir ruido del proceso anterior y amplificarlo, múltiples pasos en un ensayo sofisticado podrían implicar varios medios de arreglos de agudización/mejora específicos de la señal y reducción de ruido o arreglos de filtrado. Estos pueden tener simplemente la forma de un filtro óptico de paso de banda estrecho , o un reactivo de bloqueo en una reacción de unión que previene la unión no específica o un reactivo de extinción en un sistema de detección de fluorescencia que previene la "autofluorescencia" de los objetos de fondo. [ cita necesaria ]

Tipos de ensayo basados ​​en la naturaleza del proceso de ensayo.

Tiempo y número de mediciones tomadas.

Dependiendo de si un ensayo analiza solo un punto temporal o lecturas cronometradas tomadas en múltiples puntos temporales, un ensayo puede ser:

  1. Un ensayo de punto final , en el que se realiza una única medición después de un período de incubación fijo; o
  2. Un ensayo cinético , en el que las mediciones se realizan varias veces durante un intervalo de tiempo fijo. Los resultados del ensayo cinético se pueden visualizar numéricamente (por ejemplo, como un parámetro de pendiente que representa la tasa de cambio de la señal a lo largo del tiempo) o gráficamente (por ejemplo, como un gráfico de la señal medida en cada punto temporal). Para los ensayos cinéticos, tanto la magnitud como la forma de la respuesta medida a lo largo del tiempo proporcionan información importante.
  3. Un ensayo de alto rendimiento puede ser un criterio de valoración o un ensayo cinético que generalmente se realiza en una plataforma automatizada en formatos de microplacas de 96, 384 o 1536 pocillos ( detección de alto rendimiento ). Dichos ensayos pueden probar una gran cantidad de compuestos o analitos o realizar lecturas biológicas funcionales en respuesta a estímulos y/o compuestos que se están probando. [6]

Número de analitos detectados

Dependiendo de cuántos objetivos o analitos se estén midiendo:

  1. Los ensayos habituales son ensayos simples o de un solo objetivo , que suelen ser los predeterminados, a menos que se denominen multiplex.
  2. Los ensayos multiplex se utilizan para medir simultáneamente la presencia, concentración, actividad o calidad de múltiples analitos en una sola prueba. La llegada de la multiplexación permitió realizar pruebas de muestras rápidas y eficientes en muchos campos, incluidos la inmunología, la citoquímica, la genética/genómica, la farmacocinética y la toxicología. [7]

Tipo de resultado

Dependiendo de la calidad del resultado obtenido, los ensayos se pueden clasificar en:

  1. Ensayos cualitativos , es decir, ensayos que generalmente dan solo una aprobación o un fracaso, o positivo o negativo o algún tipo de número pequeño de gradación cualitativa en lugar de una cantidad exacta.
  2. Ensayos semicuantitativos , es decir, ensayos que dan la lectura de forma aproximada en lugar de un número exacto de la cantidad de sustancia. Generalmente tienen algunas gradaciones más que solo dos resultados, positivos o negativos, por ejemplo, puntuación en una escala de 1+ a 4+ como se usa para las pruebas de grupo sanguíneo basadas en la aglutinación de glóbulos rojos en respuesta a reactivos de grupo (anticuerpos contra antígenos de grupos sanguíneos).
  3. Ensayos cuantitativos , es decir, ensayos que dan una medida cuantitativa numérica exacta y exacta de la cantidad de una sustancia en una muestra. Un ejemplo de un ensayo de este tipo utilizado en los laboratorios de pruebas de coagulación para la enfermedad hemorrágica hereditaria más común, la enfermedad de Von Willebrand , es el ensayo de antígeno del VWF en el que se mide mediante un inmunoensayo la cantidad de VWF presente en una muestra de sangre.
  4. Ensayos funcionales , es decir, un ensayo que intenta cuantificar el funcionamiento de una sustancia activa en lugar de solo su cantidad. La contraparte funcional del ensayo del antígeno del VWF es el ensayo del cofactor de ristocetina , que mide la actividad funcional del VWF presente en el plasma de un paciente agregando plaquetas exógenas fijadas con formalina y aumentando gradualmente cantidades de un fármaco llamado ristocetina mientras se mide la aglutinación de las plaquetas fijadas. Un ensayo similar pero utilizado para un propósito diferente se llama agregación plaquetaria inducida por ristocetina o RIPA, que prueba la respuesta de las plaquetas vivas endógenas de un paciente en respuesta a la ristocetina (exógena) y el VWF (generalmente endógeno).

Tipo y método de muestra

Dependiendo del sustrato general sobre el que se aplica el principio del ensayo:

  1. Bioensayo : cuando la respuesta es la actividad biológica de objetos vivos. Ejemplos incluyen
    1. in vivo , organismo completo (por ejemplo, ratón u otro sujeto al que se le inyecta un fármaco)
    2. parte del cuerpo ex vivo (por ejemplo, pata de rana)
    3. órgano ex vivo (por ejemplo, corazón de un perro)
    4. parte ex vivo de un órgano (por ejemplo, un segmento de un intestino).
    5. tejido (por ejemplo, lisado de Limulus)
    6. célula (por ejemplo, plaquetas)
  2. Ensayo de unión de ligando cuando un ligando (generalmente una molécula pequeña) se une a un receptor (generalmente una proteína grande).
  3. Inmunoensayo cuando la respuesta es de tipo unión antígeno-anticuerpo.

amplificación de señal

Dependiendo de la naturaleza del sistema de amplificación de señal los ensayos pueden ser de numerosos tipos, por nombrar algunos:

  1. Ensayo enzimático : las enzimas se pueden probar por su actividad altamente repetitiva en una gran cantidad de sustratos cuando la pérdida de un sustrato o la fabricación de un producto puede tener un atributo medible como color o absorbancia en una longitud de onda o luz particular o electroquimioluminiscencia o electricidad/redox. actividad.
  2. Sistemas de detección de luz que pueden utilizar amplificación, por ejemplo, mediante un fotodiodo o un tubo fotomultiplicador o un dispositivo de carga acoplada enfriada .
  3. Sustratos marcados con radioisótopos como los que se utilizan en radioinmunoensayos y ensayos de diálisis de equilibrio y pueden detectarse mediante amplificación en contadores gamma o placas de rayos X, o fosforimager .
  4. Ensayos de reacción en cadena de la polimerasa que amplifican un objetivo de ADN (o ARN) en lugar de la señal
  5. Métodos combinados Los ensayos pueden utilizar una combinación de los métodos de amplificación anteriores y otros para mejorar la sensibilidad. por ejemplo, inmunoensayo ligado a enzimas o EIA, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas .

Método o tecnología de detección.

Dependiendo de la naturaleza del sistema de detección, los ensayos pueden basarse en:

  1. Formación de colonias o recuento de colonias virtuales : por ejemplo, multiplicando bacterias o proliferando células.
  2. Fotometría / espectrofotometría Cuando se mide la absorbancia de una longitud de onda específica de luz mientras pasa a través de un camino fijo a través de una cubeta de muestra de prueba líquida y la absorbancia se compara con un blanco y estándares con cantidades graduadas del compuesto objetivo. Si la luz emitida es de una longitud de onda visible específica, puede denominarse colorimetría , o puede implicar una longitud de onda de luz específica, por ejemplo, mediante el uso de láser y la emisión de señales fluorescentes de otra longitud de onda específica que se detecta mediante filtros ópticos de longitud de onda muy específica.
  3. La transmitancia de luz puede usarse para medir, por ejemplo, la eliminación de la opacidad de un líquido creado por partículas suspendidas debido a la disminución del número de grumos durante una reacción de aglutinación plaquetaria .
  4. Turbidimetría cuando la opacidad de la luz transmitida directamente que pasa a través de una muestra líquida se mide mediante detectores colocados directamente a través de la fuente de luz.
  5. Nefelometría, donde se utiliza una medición de la cantidad de dispersión de luz que se produce cuando un haz de luz pasa a través de la solución para determinar el tamaño y/o la concentración y/o la distribución del tamaño de las partículas en la muestra. [8]
  6. Reflectometría Cuando se evalúa el color de la luz reflejada por una muestra o reactivo (generalmente seco), por ejemplo, las lecturas automáticas de los ensayos con tira reactiva de orina.
  7. Mediciones viscoelásticas, por ejemplo, viscometría, elastografía (por ejemplo, tromboelastografía )
  8. Ensayos de recuento: por ejemplo, contadores ópticos de células o partículas por citometría de flujo , o contadores de células basados ​​en el principio de reja /impedancia.
  9. Ensayos de imágenes, que implican el análisis de imágenes manualmente o mediante software:
    1. Citometría : cuando un procesador de imágenes evalúa las estadísticas del tamaño de las células.
  10. La detección eléctrica, por ejemplo, mediante amperometría , voltamperometría y coulometría, se puede utilizar directa o indirectamente para muchos tipos de mediciones cuantitativas.
  11. Se pueden utilizar otros ensayos basados ​​en propiedades físicas.
    1. Osmómetro
    2. viscosímetro
    3. Electrodos selectivos de iones
    4. Pruebas sindrómicas

Tipos de ensayo basados ​​en los objetivos que se miden

ADN

Los ensayos para estudiar las interacciones de las proteínas con el ADN incluyen:

Proteína

ARN

Ensayos de recuento celular, viabilidad, proliferación o citotoxicidad.

Un ensayo de recuento de células puede determinar la cantidad de células vivas, la cantidad de células muertas o la proporción de un tipo de célula a otro, como enumerar y tipificar el rojo frente a diferentes tipos de glóbulos blancos . Esto se mide mediante diferentes métodos físicos (transmisión de luz, cambio de corriente eléctrica). Pero otros métodos utilizan el sondeo bioquímico de la estructura o fisiología celular (tinciones). Otra aplicación es la monitorización de cultivos celulares ( ensayos de proliferación celular o citotoxicidad ). Un ensayo de citotoxicidad mide qué tan tóxico es un compuesto químico para las células.

Contaminantes ambientales o alimentarios.

Surfactantes

Otros ensayos celulares

Se han desarrollado muchos ensayos celulares para evaluar parámetros específicos o la respuesta de las células ( biomarcadores , fisiología celular). Las técnicas utilizadas para estudiar las células incluyen:

Ensayo de metástasis

Petroquímica

Virología

El ensayo de título viral basado en HPCE utiliza un sistema patentado de electroforesis capilar de alto rendimiento para determinar el título de baculovirus .

El ensayo Trofile se utiliza para determinar el tropismo del VIH .

El ensayo de placa viral sirve para calcular la cantidad de virus presentes en una muestra. En esta técnica se cuenta el número de placas virales formadas por un inóculo viral, a partir del cual se puede determinar la concentración real del virus.

Secreciones celulares

Se puede detectar una amplia gama de secreciones celulares (por ejemplo, un anticuerpo o citoquina específica) utilizando la técnica ELISA . El número de células que secretan esas sustancias particulares se puede determinar utilizando una técnica relacionada, el ensayo ELISPOT .

Drogas

Calidad

Cuando varios ensayos miden el mismo objetivo, sus resultados y utilidad pueden o no ser comparables dependiendo de la naturaleza del ensayo y su metodología, confiabilidad, etc. Dichas comparaciones son posibles mediante el estudio de los atributos generales de calidad de los ensayos, por ejemplo, principios de medición (incluidos identificación, amplificación y detección), rango dinámico de detección (generalmente el rango de linealidad de la curva estándar ), sensibilidad analítica, sensibilidad funcional, especificidad analítica, valores predictivos positivos y negativos , tiempo de respuesta, es decir, tiempo necesario para finalizar un ciclo completo desde los pasos preanalíticos hasta el final del último paso postanalítico (envío/transmisión del informe), rendimiento , es decir, número de ensayos realizados por unidad de tiempo (generalmente expresado en horas), etc. Organizaciones o laboratorios que realizan ensayos con fines profesionales, por ejemplo, diagnóstico médico y Los pronósticos, análisis ambientales, procedimientos forenses, investigación y desarrollo farmacéutico deben someterse a procedimientos de garantía de calidad bien regulados , incluida la validación de métodos, calibración periódica , control de calidad analítico , pruebas de aptitud, acreditación de pruebas , concesión de licencias de pruebas y deben documentar las certificaciones apropiadas de los organismos reguladores pertinentes para poder para establecer la confiabilidad de sus ensayos, especialmente para seguir siendo legalmente aceptable y responsable de la calidad de los resultados del ensayo y también para convencer a los clientes de que utilicen su ensayo de manera comercial o profesional.

Lista de bases de datos de BioAssay

Bases de datos de bioactividad

Las bases de datos de bioactividad correlacionan estructuras u otra información química con los resultados de bioactividad obtenidos de bioensayos en la literatura, patentes y programas de detección.

Bases de datos de protocolo

Las bases de datos de protocolos correlacionan los resultados de los bioensayos con sus metadatos sobre condiciones experimentales y diseños de protocolos.

Ver también

Referencias

  1. ^ El diccionario de herencia americana del idioma inglés (4ª ed.). Boston, MA: Houghton Mifflin. 2006.ISBN​ 9780618701735.
  2. ^ Abate, Frank (2001). J. Jewell, Elizabeth (ed.). El nuevo diccionario americano de Oxford (2ª ed.). Oxford: Prensa de la Universidad de Oxford. ISBN 9780195112276.
  3. ^ "Diccionario de etimología en línea - Ensayo". etimonline . Douglas Harper. 2016 . Consultado el 13 de agosto de 2016 .
  4. ^ Bonini, P; Plebani, M; Ceriotti, F; Rubboli, F (mayo de 2002). "Errores en medicina de laboratorio". Química Clínica . 48 (5): 691–8. doi : 10.1093/clinchem/48.5.691 . PMID  11978595.
  5. ^ Hammerling, Julie A. (1 de febrero de 2012). "Una revisión de los errores médicos en el diagnóstico de laboratorio y dónde nos encontramos hoy: tabla 1". Medicina de laboratorio . 43 (2): 41–44. doi : 10.1309/LM6ER9WJR1IHQAUY .
  6. ^ Sittampalam, GS (2004). "Manual de orientación sobre ensayos [Internet]". ncbi.nlm.com . Eli Lilly & Company y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales . Consultado el 12 de agosto de 2016 .
  7. ^ Banks, Peter (7 de junio de 2010). "Ensayos multiplexados en las ciencias biológicas". biotek.com . BioTek Instruments Inc. Consultado el 13 de agosto de 2016 .
  8. ^ "Nefelometría". El diccionario gratuito . Farlex. 2016 . Consultado el 9 de septiembre de 2016 .
  9. ^ Lowry OH, Rosebrough Nueva Jersey, Farr AL, Randall RJ (noviembre de 1951). "Medición de proteínas con el reactivo Folin fenol". J. Biol. química . 193 (1): 265–75. doi : 10.1016/S0021-9258(19)52451-6 . PMID  14907713.
  10. ^ Harris, JB (2019). "Postprocesamiento de grandes datos de bioactividad" . Métodos en biología molecular. vol. 1939, págs. 37–47. doi :10.1007/978-1-4939-9089-4_3. ISBN 978-1-4939-9088-7. PMID  30848455. S2CID  73493315.
  11. ^ ab Wang, Yanli; Bryant, Stephen H.; Cheng, Tiejun; Wang, Jiyao; Gindulyte, Asta; Zapatero, Benjamín A.; Thiessen, Paul A.; Él, Siqian; Zhang, Jian (4 de enero de 2017). "PubChem BioAssay: actualización de 2017". Investigación de ácidos nucleicos . 45 (D1): D955–D963. doi : 10.1093/nar/gkw1118. PMC 5210581 . PMID  27899599. 
  12. ^ "Inicio". ensayo.biometadata.com .

enlaces externos