En 1586, tras la muerte de su padre, Rodolfo heredó el principado de Anhalt conjuntamente con sus hermanos y hermanastros, aunque siendo todavía un menor, su hermano mayor, Juan Jorge I, actuó como regente.
En 1596, con veinte años, el príncipe fue invitado a la coronación del rey Cristián IV de Dinamarca en Copenhague.
Un año más tarde, en 1602, el príncipe abandonó Suiza (donde había vivido por algún tiempo) y retornó a Dessau.
En 1603, fue acordada una división formal del principado de Anhalt entre Rodolfo y sus hermanos supervivientes.
Recibió Zerbst, donde se encontraba su residencia principal, y apoyó la renovación del Gymnasium Francisceum, comenzando por el aditamento de una biblioteca.