En el conflicto entre Enrique III y los Descontentos, se puso del lado de Francisco, el duque de Anjou, su hermano menor, y esto provocó una profunda aversión del rey contra ella.

Como reina de Navarra, también desempeñó un papel pacificador en las tormentosas relaciones entre su marido y la monarquía francesa.

[1]​ Maltratada por un hermano sombrío y rechazada por un marido oportunista, ella eligió el camino de la oposición en 1585.

Margarita aprendió a hablar italiano, español, latín y griego, además de su francés nativo.

[9]​ Durante la adolescencia de Margarita, Catalina intentó crear un matrimonio dinástico ventajoso para su hija.

[11]​ En los mismos años, Margarita tuvo una excelente relación con su hermano, y futuro rey de Francia, Enrique.

[13]​ Para Margarita era la primera tarea política de su vida y cumplió concienzudamente la misión encomendada, aunque su hermano, al regreso, ni siquiera se lo agradeció.

El libelo más exitoso fue Le Divorce Satyrique (1607), que describía a Margarita como una ninfómana.

Sin embargo, estas acusaciones difamatorias no resisten el examen cuidadoso de las fuentes.

[24]​ Los problemas comenzaron cuando la protestante Juana descubrió que Margarita no tenía intención de abjurar del catolicismo.

A pesar de las posteriores interpretaciones historiográficas, los contemporáneos no señalan ninguna insatisfacción mutua entre los futuros cónyuges.

Sin embargo, uando Catalina de Médici le preguntó a su hija si quería cancelar la boda, Margarita respondió que eso era imposible porque ella ya había tenido relaciones sexuales con Enrique y era "en todo sentido" su esposa.

Por ejemplo, en el libelo anónimo Le Réveil-matin des Français, escrito en 1574, Margarita fue acusada por primera vez de incesto con su hermano Enrique.

Alençon parecía dispuesto a comprometerse en los asuntos religiosos, lo que lo convertía en una opción atractiva para aquellos cansados de la violencia.

[41]​ Un primer complot fracasó debido a un evento inesperado y Margarita aconsejó a su supuesto amante,[42]​ Joseph Boniface de La Môle, favorito del duque de Alençon, que confesara todo al rey y la reina.

A pesar de ser presos en la corte, en el castillo de Vincennes, Alençon y Navarra organizaron un nuevo complot, pero informada por un espía, esta vez la reina madre reaccionó con fuerza, encarcelando a todos los conspiradores, entre ellas La Môle.

[44]​ Navarra y Alençon fueron obligados por la reina madre a defenderse en el parlamento contra la acusación de alta traición.

Una leyenda basada en Le Divorce Satiryque, que se hizo famosa en el siglo XIX gracias a las novelas Rojo y negro y La reina Margot, cuenta que Margarita habría robado la cabeza de La Môle para enterrarla en la chapelle de Saint-Martin en Montmartre.

[47]​ El nuevo rey, Enrique III, no habría perdonado la traición política de Margarita.

Mientras tanto, Margarita comenzó una relación con Bussy d'Amboise, nuevo favorito del duque de Alençon.

[52]​ Margarita, en cambio, permaneció al lado de su hermano Francisco, sobre el cual tuvo una gran influencia.

[N 6]​ A regañadientes y sintiéndose políticamente abandonada por su marido, Margarita dejó de compartir la cama con él.

[55]​ Sin embargo, la leyenda negra de la "Reina Margot" indicó a Margarita como la instigadora del asesinato.

[60]​ Alençon (que se había unido a los hugonotes) hizo frente al rey y rechazó toda negociación en tanto su hermana no fuera puesta en libertad.

La situación llegó a tal extremo que Alençon quiso marcharse, pero Enrique III, con la prueba de su conspiración en las manos, le hizo arrestar en plena noche y ordenó que lo encerrasen en su habitación, donde Margarita le esperaba.

Poco después, Margarita, que negaba toda participación en esa evasión, obtuvo el permiso para reunirse con su marido.

Esta concepción del amor se refleja en un diálogo titulado "La Ruelle mal assortie" (atribuido a Margarita, pero nunca probado).

Françoise dispuso constantemente al rey en contra de Margarita, esperando quizá que se casara con ella.

Ocho meses después de su partida, Margarita pudo reunirse por fin con su marido, que no estaba muy entusiasmado por el encuentro y demostró su poco interés, ilusionado como estaba con su última amante, Corisande.

El papa Clemente VIII hace efectiva la anulación matrimonial en ese mismo año, y Enrique IV se casa en 1600 con María de Médici.