A los ocho años ya entendía el latín y sabía tocar instrumentos musicales.

Ésta duró hasta 1559, en que Felipe II vuelve definitivamente a España.

En 1559, a la vuelta de Felipe II, se retiró de la vida política para dedicarse aún más a la vida religiosa, aunque siguió siendo un robusto apoyo para el partido ebolista.

En la frecuente correspondencia respecto a este asunto, la regente figuró bajo el seudónimo de Mateo Sánchez (aunque en cartas muy posteriores usara el seudónimo de Montoya) para que no se conocieran públicamente sus propósitos.

Entre todo el empeño que puso Juana de Austria en defender y promover a la Compañía de Jesús destaca: Por las repetidas relaciones enviadas a Roma sobre sus progresos, se ve que los jesuitas tomaron en serio la pertenencia de la infanta a su Orden, aun siendo única en su género y mantenida en secreto.

La hija menor de Carlos V e Isabel de Portugal pasó su infancia entre varias ciudades castellanas, manteniendo estrecha relación con su hermana mayor, María, hasta 1551, cuando María se traslada a Centroeuropa y Juana a Portugal.

En la corte lusa se familiarizó con objetos de lujo exóticos, como porcelanas orientales, de los que se haría muy aficionada y que apreciaría ya durante toda su vida.

En esta etapa vallisoletana, protege a artistas como Alonso Sánchez Coello o Pompeo Leoni.

Cuando su hermano regresó en 1559, lo hizo acompañado de Antonio Moro, quien la retrató hacia 1560.