La antigua institución decayó a causa de las reformas universitarias y administrativas de los últimos Borbones (final del siglo XVIII), que dieron primacía a la capacidad académica y profesional frente al ascenso mediante contactos entre unas pocas familias bien situadas.
El objetivo del cardenal Mendoza era seguir este modelo del Colegio Mayor para promocionar a aquellos estudiantes con altas capacidades pero sin recursos, que recibirían alojamiento y formación adicional en un recinto cerrado regido por un sistema conventual.
Después de graduarse, los licenciados y doctores podrían servir a la Corona, la Iglesia o la Universidad en una etapa en que las tres instituciones necesitaban la incorporación de mucho personal cualificado para completar su evolución hacia la Edad Moderna.
Pedro González de Mendoza dotó económicamente al Colegio Mayor con unas rentas iniciales que, a lo largo de los siglos siguientes, fueron incrementándose gracias a las donaciones y mandas testamentarias con que los antiguos colegiales reconocían su agradecimiento hacia la institución.
El gobierno de la institución estaba en manos de un Rector (máxima autoridad) y tres Consiliarios, elegidos anualmente por los colegiales reunidos en asamblea o "Capilla"; dada la importancia que para la independencia colegial tenía la buena administración económica, una de sus funciones más importantes era custodiar las cuatro llaves del arca donde se guardaba el dinero y, en definitiva, manejar las rentas.
La última palabra en casi todas las cuestiones correspondía a la Capilla, en cuyas votaciones sólo podían participar los colegiales antiguos (con más de tres años en el Colegio).
Pese a la independencia del Colegio para administrar sus asuntos, el Cabildo de Valladolid tenía autoridad para visitar el Colegio de la Santa Cruz y vigilar su buen funcionamiento.
Eran los llamados "familiares", que a cambio recibían ayuda para costearse los estudios y la manutención.
El cardenal Mendoza orientó la vida colegial hacia el espíritu propio de un convento, en un ambiente por sí mismo religioso (dado que el estatus del estudiante universitario se asimilaba al del clero).
Los colegiales a nivel personal y como colectivo defendieron una serie de privilegios que su condición les proporcionaba, pero también un honor muy apreciado.
El acceso a una beca se convirtió en algo codiciado y cada vez más restringido, mientras que a nivel interno se relajaba el rigor inicial de las Constituciones del cardenal Mendoza.
En 1981 se creó la rama femenina del Colegio Mayor Santa Cruz, abriendo así el acceso de la mujer a la institución centenaria.
El aspecto más característico de los Estatutos es la casi completa separación teórica entre las dos ramas del Colegio, que tienen al Director como única institución común.
A partir del curso académico 2023-2024, se ha llevado a cabo este cambio que establece ambas sedes como mixtas, en ambas cuales pueden alojarse colegiales y colegialas.