Sus abuelos paternos eran el emperador Fernando I de Habsburgo y Ana de Bohemia, hija a su vez de Vladislao II, rey de Bohemia y Hungría.

El compromiso matrimonial de Segismundo III de Polonia con Ana no fue visto con buenos ojos por la nobleza polaca, liderada por el canciller Juan Zamoyski, quien observaba en ello las pretensiones de los Habsburgo de entrometerse en Polonia, en alianza con el rey Segismundo.

Cuando el rey Segismundo envió una misión diplomática a Praga, lugar donde se hallaba Ana, con el fin de llevarla a Polonia, Zamoyski ordenó vigilar las fronteras para impedirle el paso, pero la caravana de Ana logró evadir la vigilancia y llegar a Cracovia, lugar donde se celebraría el matrimonio el 31 de mayo de 1592.

Tanto su marido como ella, dada la convicción católica de ambos, fueron vistos con desconfianza por la aristocracia sueca, de confesión luterana.

De su matrimonio nacieron cinco hijos, de los cuales solo Vladislao llegó a la edad adulta: Ana falleció en Varsovia el 2 de febrero de 1598, a los 24 años de edad al dar a luz a su quinto vástago, que tampoco sobrevivió.