Las pioverdinas [1] (alternativamente, y con menos frecuencia, escritas como pioverdinas ) son sideróforos fluorescentes producidos por ciertas pseudomonas . [2] [3] Las pioverdinas son factores de virulencia importantes y son necesarias para la patogénesis en muchos modelos biológicos de infección . Sus contribuciones a la patogénesis bacteriana incluyen proporcionar un nutriente crucial (es decir, hierro ), la regulación de otros factores de virulencia (incluida la exotoxina A y la proteasa PrpL), [4] apoyar la formación de biopelículas , [5] y cada vez se reconoce más por tener toxicidad en sí mismas. [6] [7] [8]
Las pioverdinas también se han investigado como moléculas de " caballo de Troya " para la administración de antimicrobianos a cepas bacterianas que de otro modo serían resistentes , como quelantes que pueden usarse para la biorremediación de metales pesados y como reporteros fluorescentes utilizados para analizar la presencia de hierro y potencialmente otros metales. [9]
Debido a que unen la patogenicidad , el metabolismo del hierro y la fluorescencia, las pioverdinas han despertado la curiosidad de científicos de todo el mundo durante más de 100 años. [ cita requerida ]
Al igual que la mayoría de los sideróforos, la pioverdina se sintetiza y se secreta al medio ambiente cuando el microorganismo que la produce detecta que las concentraciones intracelulares de hierro han caído por debajo de un umbral preestablecido. Aunque el hierro es el cuarto elemento más abundante en la corteza terrestre , la solubilidad de los compuestos de hierro biológicamente relevantes es extremadamente baja y, por lo general, insuficiente para las necesidades de la mayoría de los microorganismos (pero no todos). Los sideróforos, que suelen ser bastante solubles y tienen una avidez excepcionalmente alta por el hierro (III) (la avidez de algunos sideróforos por el hierro supera los 10 40 M -1 y muchas de las avideces más fuertes jamás observadas en la naturaleza las exhiben los sideróforos por el hierro), ayudan a aumentar la biodisponibilidad del hierro al atraerlo a la solución acuosa.
Además de esta función, la pioverdina tiene otras funciones, entre ellas, regular la virulencia, [4] [5] limitar el crecimiento de otras especies bacterianas (y actuar como una especie de antimicrobiano) al limitar la disponibilidad de hierro y secuestrar otros metales y prevenir su toxicidad.
Aunque se han aislado y estudiado muchas (>100) formas de pioverdina, todas tienen ciertas características en común. Cada molécula de pioverdina tiene tres partes: un núcleo de dihidroxiquinolina, un péptido de 6-14 aminoácidos que varía entre cepas y una cadena lateral (generalmente compuesta por un α -cetoácido de 4-5 carbonos del ciclo de Krebs/ácido cítrico ). El núcleo de la pioverdina es responsable de varias de sus propiedades, incluido su conocido color amarillento y fluorescencia.
El núcleo de dihidroxiquinolina está compuesto por ácido (1S)-5-amino-2,3-dihidro-8,9-dihidroxi-1H-pirimido[1,2-a] quinolina -1-carboxílico. Esta porción de la molécula es invariable entre todas las moléculas de pioverdina observadas.
El núcleo se modifica mediante la adición de una cadena de aminoácidos compuesta de 6-14 aminoácidos. La cadena de aminoácidos se construye sobre el núcleo cromóforo y se sintetiza a través de la síntesis de péptidos no ribosómicos . [10] [11] Como es común para los péptidos no sintetizados ribosomalmente, la pioverdina incluye con frecuencia aminoácidos en forma D y aminoácidos no estándar, como N -5-formil- N -5-hidroxiornitina . La cadena peptídica también puede estar parcialmente (o completamente) ciclizada. Esta cadena peptídica proporciona los otros cuatro aspectos de la interacción hexadentada , generalmente a través de grupos hidroxamato y/o hidroxicarboxilato. Esta porción de la molécula también es crucial para la interacción con el receptor de ferripyoverdina (FpvA) que permite que la ferripyoverdina se importe a la célula. Actualmente se piensa que la cadena peptídica producida por una cepa dada de Pseudomonas es invariable.
Se sabe poco sobre la función particular o la importancia de la cadena lateral del cetoácido, pero es bien sabido [12] que las moléculas de pioverdina con diferentes cetoácidos ( congéneres ) coexisten. Los cetoácidos que se han observado incluyen succinato / succinamida , glutamato , glutarato , malato /malamida y α-cetoglutarato .
Entre sus otras características notables, las pioverdinas exhiben una fluorescencia brillante, relativamente fotoestable, con espectros de excitación y emisión característicos que se extinguen rápidamente y fuertemente al unirse a su ligando natural , el hierro. La excitación y la absortividad molar muestran una dependencia moderada del pH , pero la fluorescencia generalmente no se ve afectada por las variaciones del pH . A diferencia de la fluorescencia, la absorción espectroscópica muestra poca extinción al unirse al hierro , lo que sugiere que el mecanismo de relajación molecular es vibracional, en lugar de a través de la radiación electromagnética .
La pioverdina coordina una quelación hexadentada (es decir, de seis partes) de hierro que involucra seis átomos de oxígeno diferentes (2 del núcleo de dihidroxiquinolina y 2 de cada uno de los 2 aminoácidos diferentes en la cadena principal). Esto da como resultado un complejo octaédrico muy estrechamente coordinado que evita de manera eficiente la entrada de agua u otros materiales que puedan interrumpir la unión. Por lo general, el hierro férrico se elimina de la pioverdina mediante reducción al estado ferroso , para el cual la pioverdina tiene una avidez mucho menor (es decir, 10 9 M -1 ). Esto permite la eliminación no destructiva del hierro de la pioverdina. Después de la reducción, el hierro se "transfiere" a otros portadores que tienen una mayor afinidad por el hierro ferroso, mientras que la apopioverdina se reexporta para su uso continuo.
La pioverdina es estructuralmente similar a la azobactina, de Azotobacter vinelandii , excepto que esta última posee un anillo de urea adicional. [13]
En Pseudomonas aeruginosa PAO1 hay 14 genes pvd involucrados en la biosíntesis de pioverdina. [14]
La biosíntesis de pioverdina parece estar regulada en gran medida por la actividad del factor sigma alternativo PvdS que, a su vez, está regulado tanto por el sistema Fur como por el secuestro intracelular de PvdS en la membrana plasmática y lejos del nucleoide por el represor FpvI.
A pesar de la importante investigación, se sabe relativamente poco sobre la biosíntesis de la pioverdina. Por ejemplo, no está claro si la biosíntesis de la pioverdina se lleva a cabo como componentes individuales (es decir, el núcleo, la cadena peptídica y el cetoácido) o si el núcleo y las otras partes se condensan como una molécula inicial (posiblemente por la proteína PvdL) y luego se modifican por otras enzimas posteriormente. Por razones que siguen sin estar claras, la biosíntesis de la pioverdina está fuertemente inhibida por el fluorouracilo terapéutico contra el cáncer , [15] particularmente a través de su capacidad para alterar el metabolismo del ARN. [16] Aunque la producción de pioverdinas varía de una cepa a otra, se ha demostrado que las especies fluorescentes de Pseudomonas producen entre 200 y 500 mg/L cuando se cultivan en condiciones de agotamiento de hierro. [17] [18]
Existe cierta controversia sobre el origen del núcleo cromóforo fluorescente. Originalmente, se pensaba que era sintetizado por el operón pvcABCD , ya que la eliminación de partes de los genes pvcC y pvcD interrumpe la producción de pioverdina. [19] Al igual que otros aspectos de la biosíntesis de pioverdina, la regulación del pvcABCD depende del hierro, y la pérdida de la actividad de estos genes resultó en la interrupción de la pioverdina.
Un informe independiente sugiere que pvcABCD puede ser responsable de la síntesis de paerucumarin (una molécula relacionada con la pseudoverdina), y afirma que la pérdida de actividad en el locus no tiene efecto sobre la producción de pioverdina. [20] Además, algunas Pseudomonas fluorescentes carecen de homólogos aparentes de estos genes, lo que pone aún más en duda si esta es la función de estos genes.
Esto es consistente con los informes de que pvdL combina la coenzima A con una fracción de ácido mirístico , luego agrega un glutamato, D-tirosina y ácido L-2,4-diaminobutírico (DAB). [21] Una vía biosintética alternativa sugiere que pvdL incorpora glutamato, 2,4,5-trihidroxifenilalanina y ácido L-2,4-daminobutírico en su lugar. [22] Esto último está respaldado por la identificación de la incorporación de una tirosina radiomarcada en pioverdina o pseudoverdina.
Esta discrepancia sigue sin resolverse.
Varios de los genes responsables de la biosíntesis de pioverdina (por ejemplo, pvdH, pvdA y pvdF ) están involucrados en la generación de aminoácidos precursores y alternativos necesarios para varias porciones de la molécula. [23] Varios otros (por ejemplo, pvdI y pvdJ ) son directamente responsables de "unir" la cadena peptídica. [23] pvdD termina la cadena y libera el precursor en el citoplasma , lo que es consistente con la identificación de moléculas similares a la pioverdina en el citoplasma con cromóforos incompletamente maduros. [23]
Actualmente, la mejor evidencia disponible sugiere que el cetoácido se une originalmente al núcleo cromóforo (como L-glutamato) cuando se sintetiza a partir de D-tirosina, ácido L-2,4-diaminobutírico y L-glutamato. No está claro cómo esto se altera posteriormente a las otras formas congeneradas (es decir, a-cetoglutarato , succinato / succinamida , etc.).
La localización de algunas de las proteínas Pvd en el periplasma y la membrana externa (como PvdN, PvdO, PvdP y PvdQ) se ha interpretado como que sugiere que partes de la maduración de la pioverdina tienen lugar en esta ubicación, tal vez después de ser transportadas al periplasma por PvdE, que es homóloga a los exportadores de tipo ABC . No está claro cómo se exporta la pioverdina completamente madura desde la célula. Una vez que madura por completo, la pioverdina se exporta desde el periplasma mediante la bomba de eflujo PvdRT-OpmQ .
Se ha informado de una vía de síntesis orgánica completa para la pioverdina producida por la cepa PAO1 de P. aeruginosa [24] mediante síntesis de péptidos en fase sólida . Este protocolo produjo pioverdina con un alto rendimiento (~48%) y se espera que aumente sustancialmente la capacidad de los científicos para generar derivados específicos en el andamiaje de pioverdina y facilitar la creación de sideróforos con ojivas antimicrobianas.
Se ha informado que la pioverdina es necesaria para la virulencia en una variedad de modelos de enfermedades , incluidos C. elegans y varios modelos de infección murina (por ejemplo, modelos de quemaduras, modelos de neumonía, etc.). [6] [15] [25] [26]
Como se señaló anteriormente, la pioverdina contribuye de varias maneras a la virulencia general, incluida la regulación de la producción de sí misma, de la exotoxina A (que detiene la traducción) y de la proteasa PrpL. [4] También hay evidencia de que, aunque no es esencial para su formación, la pioverdina contribuye a la producción y el desarrollo de biopelículas que son importantes para la virulencia. [5]
Por último, la pioverdina se asocia a varios tipos de toxicidad por derecho propio. En 2001, Albesa y sus colegas informaron que la pioverdina purificada de una cepa de P. fluorescens exhibió una citotoxicidad profunda para los macrófagos de mamíferos y que este efecto dependía al menos parcialmente de las especies reactivas de oxígeno . [27] Más tarde, Kirienko y sus colegas determinaron que la pioverdina es necesaria y suficiente para matar a C. elegans , que ingresa a las células huésped, desestabiliza la dinámica mitocondrial e induce una respuesta hipóxica . [6] [7] La exposición desencadena una respuesta que es consistente con la hipoxia que depende de la proteína HIF-1 , lo que sugiere que el huésped percibe una condición en la que carece de las herramientas moleculares para generar ATP (generalmente, hierro, oxígeno y equivalentes reductores celulares) . [6] [7]
Una vez secretada la pioverdina, se difunde libremente en el medio ambiente. La pioverdina unida al hierro (también conocida como ferripyoverdina) puede ser absorbida por cualquier célula bacteriana con el receptor apropiado , aunque esto varía entre cepas. [28] Es importante destacar que esto crea un bien común que puede ser explotado por los "tramposos" que conservan la capacidad de usar pioverdina pero han dejado de producirla. Dado que la producción de pioverdina es energéticamente costosa, esto puede crear una ventaja de aptitud en las células que no la sintetizan. [29] [30] [31] [32] En consecuencia, la pioverdina se ha convertido en un rasgo modelo para estudiar la cooperación y la explotación microbianas . [33] [34]
En P. aeruginosa , se ha demostrado que las bacterias “tramposas” no productoras de pioverdina i) evolucionan fácilmente a partir de un ancestro productor; [35] y ii) superan a las cepas cooperantes en cultivos mixtos de una manera dependiente de la densidad y la frecuencia. [36] [37] Dado que el uso de pioverdina depende de la difusión pasiva y la producción de pioverdina es metabólicamente costosa, se sabe que las condiciones ambientales influyen en la probabilidad de explotación exitosa. Se demostró que la ventaja competitiva de los no productores de pioverdina sobre los productores en cultivos mixtos se maximiza cuando los entornos están bien mezclados y las moléculas se difunden fácilmente (baja estructura espacial) y cuando los costos y beneficios de la producción de pioverdina son altos, es decir, cuando el hierro está fuertemente limitado. [31] [38] La mayoría de los estudios sobre la cooperación y el engaño de la pioverdina se han realizado utilizando aislados clínicos, pero la explotación de sideróforos también se demostró recientemente en aislados naturales de Pseudomonas de muestras no clínicas. [39] [40]
En la actualidad, no se utiliza una nomenclatura generalizada y sistemática para diferenciar las estructuras de la pioverdina. En 1989 [41] se propuso un sistema que constaba de pioverdina tipo I, tipo IIa, tipo IIb y tipo III. En ese momento, solo se conocían unas pocas estructuras de pioverdina y se preveía que se produciría una variación mucho menor de la observada hasta ahora. Como consecuencia de la tremenda heterogeneidad observada en la estructura principal del péptido y la observación de congéneres (pioverdinas de una única cepa que difieren solo en sus porciones cetoácidas), la nomenclatura de las pioverdinas sigue siendo bastante tenue y ningún sistema único ha obtenido una aceptación universal.
Un compuesto relacionado con la pioverdina, llamado pseudoverdina (formalmente conocido como 3-formilamino-6,7-dihidroxicumarina) también es producido por algunas Pseudomonas fluorescentes. [42] Se cree que la pseudoverdina y la pioverdina pueden surgir de un precursor común, la 2,4,5-trihidroxifenilalanina, que puede condensarse con ácido L-2,4-diaminobutírico para iniciar la producción de pioverdina. [42]
La pseudoverdina es relativamente similar a la pioverdina en su fluorescencia y otras propiedades espectroscópicas , y en su capacidad para quelar el hierro férrico, aunque con una afinidad mucho menor . [42] A diferencia de la pioverdina, es incapaz de transportar hierro a las células , probablemente debido a la ausencia de la cadena peptídica. [42] Otra diferencia es que la pseudoverdina no parece estar regulada por los mismos procesos que la pioverdina. [42]