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Transfección

La transfección es el proceso de introducir deliberadamente ácidos nucleicos desnudos o purificados en células eucariotas . [1] [2] También puede referirse a otros métodos y tipos de células, aunque a menudo se prefieren otros términos: " transformación " se utiliza normalmente para describir la transferencia de ADN no viral en bacterias y células eucariotas no animales , incluidas las células vegetales. En las células animales, la transfección es el término preferido ya que la transformación también se utiliza para referirse a la progresión a un estado canceroso ( carcinogénesis ) en estas células. La transducción se utiliza a menudo para describir la transferencia de genes mediada por virus a células eucariotas. [2] [3]

La palabra transfección es una combinación de trans- e infección . El material genético (como el ADN plasmídico superenrollado o las construcciones de ARNi ) puede ser transfectado. La transfección de células animales generalmente implica la apertura de poros transitorios o "agujeros" en la membrana celular para permitir la absorción de material. La transfección puede llevarse a cabo utilizando fosfato de calcio (es decir, fosfato tricálcico ), por electroporación , por compresión celular o mezclando un lípido catiónico con el material para producir liposomas que se fusionan con la membrana celular y depositan su carga en el interior.

La transfección puede dar lugar a morfologías y anomalías inesperadas en las células objetivo.

Terminología

El significado del término ha evolucionado. [4] El significado original de transfección era "infección por transformación", es decir, la introducción de material genético, ADN o ARN, de un virus o bacteriófago que infecta procariotas en las células, lo que da como resultado una infección. Para el trabajo con células bacterianas y arqueales, la transfección conserva su significado original como un caso especial de transformación. Debido a que el término transformación tenía otro sentido en la biología celular animal (un cambio genético que permite la propagación a largo plazo en cultivo, o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerosas), el término transfección adquirió, para las células animales, su significado actual de un cambio en las propiedades celulares causado por la introducción de ADN. [ cita requerida ]

Métodos

Existen varios métodos para introducir ADN extraño en una célula eucariota : algunos se basan en un tratamiento físico (electroporación, compresión celular, nanopartículas , magnetofección); otros se basan en materiales químicos o partículas biológicas (virus) que se utilizan como portadores. Existen muchos métodos diferentes de administración de genes desarrollados para varios tipos de células y tejidos, desde bacterias hasta mamíferos. En general, los métodos se pueden dividir en tres categorías: físicos, químicos y biológicos. [5]

Los métodos físicos incluyen electroporación , microinyección , pistola de genes , impalefección , presión hidrostática , infusión continua y sonicación. Los métodos químicos incluyen métodos como lipofección , que es un proceso de transfección de ADN mediado por lípidos que utiliza vectores liposómicos. También puede incluir el uso de portadores de genes poliméricos (poliplexos). [6] La transfección biológica generalmente está mediada por virus , que utilizan la capacidad de un virus para inyectar su ADN dentro de una célula huésped. Un gen que está destinado a ser administrado se empaqueta en una partícula viral deficiente en replicación. Los virus utilizados hasta la fecha incluyen retrovirus , lentivirus , adenovirus , virus adenoasociados y virus del herpes simple . [ cita requerida ]

Métodos físicos

Electroporador con formas de onda de decaimiento exponencial y onda cuadrada para aplicaciones de electroporación in vitro, in vivo, de células adherentes y de 96 pocillos. Fabricado por BTX Harvard Apparatus, Holliston MA, EE. UU.

Los métodos físicos son los más simples desde el punto de vista conceptual y utilizan medios físicos para forzar la entrada del material transfectado en el núcleo de la célula diana. El método físico más utilizado es la electroporación , en la que pulsos eléctricos cortos rompen la membrana celular, lo que permite que los ácidos nucleicos transfectados entren en la célula. [5] Otros métodos físicos utilizan medios diferentes para hacer agujeros en la membrana celular: la sonoporación utiliza ultrasonidos de alta intensidad (atribuidos principalmente a la cavitación de burbujas de gas que interactúan con las membranas celulares cercanas), la transfección óptica utiliza un láser altamente enfocado para formar un agujero de ~1 μm de diámetro. [7]

Varios métodos utilizan herramientas que fuerzan el ácido nucleico a entrar en la célula, a saber: microinyección de ácido nucleico con una aguja fina; [5] administración de partículas biolísticas , en la que el ácido nucleico se une a partículas de metales pesados ​​(generalmente oro) y se impulsa hacia las células a alta velocidad; [8] y magnetofección , donde los ácidos nucleicos se unen a partículas magnéticas de óxido de hierro y se impulsan hacia las células objetivo mediante imanes. [8]

La administración hidrodinámica es un método utilizado en ratones y ratas, en el que los ácidos nucleicos pueden administrarse al hígado inyectando un volumen relativamente grande en la sangre en menos de 10 segundos; casi todo el ADN se expresa en el hígado mediante este procedimiento. [9]

Métodos químicos

La transfección de base química se puede dividir en varios tipos: ciclodextrina , [10] polímeros, [11] liposomas o nanopartículas [12] (con o sin funcionalización química o viral. Ver más abajo).

Métodos virales

El ADN también se puede introducir en las células utilizando virus como portadores. En estos casos, la técnica se denomina transducción y se dice que las células son transducidas. Los vectores adenovirales pueden ser útiles para los métodos de transfección viral porque pueden transferir genes a una amplia variedad de células humanas y tienen altas tasas de transferencia. [2] Los vectores lentivirales también son útiles debido a su capacidad para transducir células que actualmente no están experimentando mitosis.

La fusión de protoplastos es una técnica en la que las células bacterianas transformadas se tratan con lisozima para eliminar la pared celular. A continuación, se utilizan agentes fusogénicos (por ejemplo, virus Sendai, PEG, electroporación) para fusionar el protoplasto portador del gen de interés con la célula receptora diana. Una desventaja importante de este método es que los componentes bacterianos también se introducen de forma no específica en la célula diana.

Transfección estable y transitoria

La transfección estable y transitoria difieren en sus efectos a largo plazo sobre una célula; una célula transfectada de forma estable expresará continuamente el ADN transfectado y lo transmitirá a las células hijas , mientras que una célula transfectada de forma transitoria expresará el ADN transfectado durante un breve período de tiempo y no lo transmitirá a las células hijas.

Para algunas aplicaciones de la transfección, es suficiente que el material genético transfectado se exprese sólo transitoriamente. Dado que el ADN introducido en el proceso de transfección normalmente no se integra en el genoma nuclear, el ADN extraño se diluirá a través de la mitosis o se degradará. [5] Las líneas celulares que expresan el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (VEB) (EBNA1) o el antígeno de T grande del SV40 permiten la amplificación episomal de plásmidos que contienen los orígenes de replicación virales del VEB (293E) o del SV40 (293T), lo que reduce en gran medida la tasa de dilución. [25]

Si se desea que el gen transfectado permanezca realmente en el genoma de la célula y sus células hijas, debe producirse una transfección estable. Para lograr esto, se cotransfecta un gen marcador , lo que le da a la célula alguna ventaja seleccionable, como la resistencia a una determinada toxina . Algunas (muy pocas) de las células transfectadas habrán integrado, por casualidad, el material genético extraño en su genoma. Si luego se añade la toxina al cultivo celular, solo aquellas pocas células con el gen marcador integrado en sus genomas podrán proliferar , mientras que otras células morirán. Después de aplicar este estrés selectivo (presión de selección) durante algún tiempo, solo las células con una transfección estable permanecen y pueden seguir cultivándose. [26]

Los agentes comunes para seleccionar la transfección estable son:

Transfección de ARN

El ARN también se puede transfectar en células para expresar transitoriamente su proteína codificada o para estudiar la cinética de descomposición del ARN . La transfección del ARN se utiliza a menudo en células primarias que no se dividen.

Los ARNi también pueden transfectarse para lograr el silenciamiento del ARN (es decir, la pérdida de ARN y proteína del gen diana). Esto se ha convertido en una aplicación importante en la investigación para lograr la " eliminación " de proteínas de interés (por ejemplo, Endotelina-1 [27] ) con posibles aplicaciones en la terapia génica. Las limitaciones del enfoque de silenciamiento son la toxicidad de la transfección para las células y los posibles efectos "fuera del objetivo" en la expresión de otros genes/proteínas.

El ARN se puede purificar a partir de células después de la lisis o sintetizar a partir de nucleótidos libres , ya sea químicamente o enzimáticamente utilizando una ARN polimerasa para transcribir una plantilla de ADN . Al igual que con el ADN, el ARN se puede administrar a las células por una variedad de medios, incluyendo microinyección , electroporación y transfección mediada por lípidos . Si el ARN codifica una proteína , las células transfectadas pueden traducir el ARN en la proteína codificada. [28] Si el ARN es un ARN regulador (como un miARN ), el ARN puede causar otros cambios en la célula (como la eliminación mediada por ARNi ).

La encapsulación de la molécula de ARN en nanopartículas lipídicas fue un gran avance para producir vacunas de ARN viables , resolviendo una serie de barreras técnicas clave para la administración de la molécula de ARN a la célula humana. [29] [30]

Las moléculas de ARN más cortas que unos 25 nt (nucleótidos) evaden en gran medida la detección por parte del sistema inmunitario innato , que se activa con moléculas de ARN más largas. La mayoría de las células del cuerpo expresan proteínas del sistema inmunitario innato y, al exponerse a moléculas de ARN largas exógenas, estas proteínas inician cascadas de señalización que dan lugar a inflamación . Esta inflamación hipersensibiliza a la célula expuesta y a las células cercanas a la exposición posterior. Como resultado, mientras que una célula puede ser transfectada repetidamente con ARN corto con pocos efectos no específicos, la transfección repetida de células incluso con una pequeña cantidad de ARN largo puede causar la muerte celular a menos que se tomen medidas para suprimir o evadir el sistema inmunitario innato (ver "Transfección de ARN largo" a continuación).

La transfección de ARN corto se utiliza rutinariamente en la investigación biológica para inhibir la expresión de una proteína de interés (usando ARNi ) o para expresar o bloquear la actividad de un miARN (usando ARN corto que actúa independientemente de la maquinaria de ARNi de la célula y, por lo tanto, no se conoce como ARNi). Si bien también se pueden usar vectores basados ​​en ADN ( virus , plásmidos ) que codifican una molécula de ARN corto, la transfección de ARN corto no corre el riesgo de modificar el ADN de la célula, una característica que ha llevado al desarrollo del ARN corto como una nueva clase de fármacos macromoleculares . [31]

La transfección de ARN largo es el proceso de introducir deliberadamente moléculas de ARN de más de 25 nt en células vivas. Se hace una distinción entre la transfección de ARN corto y la de ARN largo porque las moléculas de ARN largo exógenas provocan una respuesta inmunitaria innata en las células que puede causar una variedad de efectos no específicos, como el bloqueo de la traducción , la detención del ciclo celular y la apoptosis .

ARN largo endógeno vs. exógeno

El sistema inmunológico innato ha evolucionado para proteger contra infecciones detectando patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), y desencadenando un conjunto complejo de respuestas conocidas colectivamente como " inflamación ". Muchas células expresan receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) específicos para ARN exógeno incluyendo el receptor tipo toll 3,7,8 ( TLR3 , TLR7 , TLR8 ), [32] [33] [34] [ 35] la ARN helicasa RIG1 (RARRES3) , [36] la proteína quinasa R (PKR, también conocida como EIF2AK2), [37] [38] miembros de la familia de proteínas de la oligoadenilato sintetasa ( OAS1 , OAS2 , OAS3 ), y otros. Todas estas proteínas pueden unirse específicamente a moléculas de ARN exógeno y desencadenar una respuesta inmune. Las características químicas, estructurales u otras características específicas de las moléculas de ARN largas que son requeridas para el reconocimiento por PRR siguen siendo en gran parte desconocidas a pesar de un estudio intenso. En un momento dado, una célula de mamífero típica puede contener varios cientos de miles de ARNm y otras moléculas de ARN largo reguladoras . Cómo las células distinguen el ARN largo exógeno de la gran cantidad de ARN largo endógeno es una importante pregunta abierta en biología celular . Varios informes sugieren que la fosforilación del extremo 5' de una molécula de ARN largo puede influir en su inmunogenicidad , y específicamente que el ARN 5'-trifosfato, que se puede producir durante la infección viral, es más inmunogénico que el ARN 5'-difosfato, el ARN 5'-monofosfato o el ARN que no contiene fosfato 5'. [39] [40] [41] [42] [43] [44] Sin embargo, el ARN largo transcrito in vitro (ivT) que contiene una tapa de 7-metilguanosina (presente en el ARNm eucariota ) también es altamente inmunogénico a pesar de no tener fosfato 5', [45] lo que sugiere que características distintas de la 5'-fosforilación pueden influir en la inmunogenicidad de una molécula de ARN.

El ARNm eucariota contiene nucleótidos modificados químicamente, como N 6 -metiladenosina , 5-metilcitidina y nucleótidos 2'-O-metilados . Aunque solo una cantidad muy pequeña de estos nucleótidos modificados están presentes en una molécula típica de ARNm, pueden ayudar a evitar que el ARNm active el sistema inmunológico innato al alterar la estructura secundaria que se parecería al ARN bicatenario (dsRNA), [46] [34] un tipo de ARN que se cree que está presente en las células solo durante la infección viral. La inmunogenicidad del ARN largo se ha utilizado para estudiar tanto la inmunidad innata como la adaptativa .

Transfección repetida de ARN largo

La inhibición de sólo tres proteínas, interferón-β , STAT2 y EIF2AK2 , es suficiente para rescatar a los fibroblastos humanos de la muerte celular causada por la transfección frecuente con ARN largo que codifica proteínas. [45] La inhibición de la señalización del interferón interrumpe el ciclo de retroalimentación positiva que normalmente hipersensibiliza a las células expuestas al ARN largo exógeno. Los investigadores han utilizado recientemente esta técnica para expresar proteínas de reprogramación en fibroblastos humanos primarios . [47]

Véase también

Referencias

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Lectura adicional

Enlaces externos

Scholia tiene un perfil de transfección (Q1429031).