En análisis químico , la cromatografía es una técnica de laboratorio para la separación de una mezcla en sus componentes. La mezcla se disuelve en un disolvente fluido (gas o líquido) llamado fase móvil , que la transporta a través de un sistema (una columna, un tubo capilar, una placa o una lámina) sobre el que se fija un material llamado fase estacionaria . Debido a que los diferentes constituyentes de la mezcla tienden a tener diferentes afinidades por la fase estacionaria y se retienen durante diferentes períodos de tiempo dependiendo de sus interacciones con sus sitios superficiales, los constituyentes viajan a diferentes velocidades aparentes en el fluido móvil, lo que hace que se separen. La separación se basa en la partición diferencial entre las fases móvil y estacionaria. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de un compuesto dan como resultado una retención diferencial en la fase estacionaria y, por lo tanto, afectan la separación. [1]
La cromatografía puede ser preparativa o analítica . El propósito de la cromatografía preparativa es separar los componentes de una mezcla para su uso posterior y, por tanto, es una forma de purificación . [2] [3] Este proceso está asociado a mayores costos debido a su modo de producción. [4] [5] La cromatografía analítica se realiza normalmente con cantidades más pequeñas de material y sirve para establecer la presencia o medir las proporciones relativas de analitos en una mezcla. Los dos tipos no son mutuamente excluyentes. [6]
La cromatografía, pronunciada / ˌ k r oʊ m ə ˈ t ɒ ɡ r ə f i / , se deriva del griego χρῶμα chroma , que significa " color ", y γράφειν graphein , que significa "escribir". La combinación de estos dos términos fue heredada directamente de la invención de la técnica utilizada por primera vez para separar pigmentos biológicos . [7]
La cromatografía fue ideada por primera vez en la Universidad de Kazán por el científico ruso nacido en Italia Mikhail Tsvet en 1900. [8] [9] Desarrolló la técnica y acuñó el término cromatografía en la primera década del siglo XX, principalmente para la separación de pigmentos vegetales como clorofila , carotenos y xantofilas . Dado que estos componentes se separan en bandas de diferentes colores (verde, naranja y amarillo, respectivamente) inspiraron directamente el nombre de la técnica. Los nuevos tipos de cromatografía desarrollados durante las décadas de 1930 y 1940 hicieron que la técnica fuera útil para muchos procesos de separación . [10]
La técnica de cromatografía se desarrolló sustancialmente como resultado del trabajo de Archer John Porter Martin y Richard Laurence Millington Synge durante las décadas de 1940 y 1950, por el que ganaron el Premio Nobel de Química en 1952 . [11] Establecieron los principios y las técnicas básicas de la cromatografía de partición, y su trabajo fomentó el rápido desarrollo de varios métodos cromatográficos: cromatografía en papel , cromatografía de gases y lo que se conocería como cromatografía líquida de alta resolución . Desde entonces, la tecnología ha avanzado rápidamente. Los investigadores descubrieron que los principios fundamentales de la cromatografía de Tsvet se podían aplicar de muchas maneras diferentes, lo que dio como resultado las diferentes variedades de cromatografía que se describen a continuación. Los avances mejoran continuamente las prestaciones técnicas de la cromatografía, permitiendo la separación de moléculas cada vez más similares.
La cromatografía se basa en el concepto de coeficiente de partición. Cualquier soluto se divide entre dos disolventes inmiscibles. Cuando se hace que un disolvente sea inmóvil (mediante adsorción en una matriz de soporte sólido) y otro móvil, se obtienen las aplicaciones más comunes de cromatografía. Si el soporte de la matriz, o fase estacionaria, es polar (por ejemplo, celulosa , sílice , etc.), se trata de cromatografía de fase directa. De lo contrario, esta técnica se conoce como fase inversa, donde se utiliza una fase estacionaria no polar (por ejemplo, derivada no polar de C-18 ).
La cromatografía en columna es una técnica de separación en la que el lecho estacionario está dentro de un tubo. Las partículas de la fase estacionaria sólida o el soporte recubierto con una fase estacionaria líquida pueden llenar todo el volumen interior del tubo (columna empacada) o concentrarse en o a lo largo de la pared interior del tubo dejando un camino abierto y sin restricciones para la fase móvil en la parte media del tubo (columna tubular abierta). Las diferencias en las velocidades de movimiento a través del medio se calculan para diferentes tiempos de retención de la muestra. [13] [14] En 1978, W. Clark Still introdujo una versión modificada de la cromatografía en columna llamada cromatografía en columna flash (flash). [15] [16] La técnica es muy similar a la cromatografía en columna tradicional, excepto que el disolvente se conduce a través de la columna aplicando presión positiva. Esto permitió que la mayoría de las separaciones se realizaran en menos de 20 minutos, con separaciones mejoradas en comparación con el método anterior. Los sistemas de cromatografía flash modernos se venden como cartuchos de plástico preenvasados y el disolvente se bombea a través del cartucho. Los sistemas también pueden vincularse con detectores y recolectores de fracciones que proporcionen automatización. La introducción de bombas de gradiente dio como resultado separaciones más rápidas y un menor uso de solventes.
En la adsorción en lecho expandido , se utiliza un lecho fluidizado, en lugar de una fase sólida formada por un lecho empacado. Esto permite omitir los pasos de limpieza iniciales, como la centrifugación y la filtración, para caldos de cultivo o suspensiones de células rotas.
La cromatografía de fosfocelulosa utiliza la afinidad de unión de muchas proteínas de unión al ADN por la fosfocelulosa. Cuanto más fuerte sea la interacción de una proteína con el ADN, mayor será la concentración de sal necesaria para eluir esa proteína. [17]
La cromatografía plana es una técnica de separación en la que la fase estacionaria está presente como o sobre un plano. El plano puede ser un papel que sirve como tal o impregnado por una sustancia como lecho estacionario ( cromatografía en papel ) o una capa de partículas sólidas extendidas sobre un soporte como una placa de vidrio ( cromatografía en capa fina ). Los diferentes compuestos de la mezcla de muestra viajan distancias diferentes según la fuerza con la que interactúan con la fase estacionaria en comparación con la fase móvil. El factor de retención específico (Rf ) de cada sustancia química se puede utilizar para ayudar en la identificación de una sustancia desconocida.
La cromatografía en papel es una técnica que consiste en colocar un pequeño punto o línea de solución de muestra en una tira de papel de cromatografía . El papel se coloca en un recipiente con una capa poco profunda de disolvente y se sella. A medida que el solvente sube a través del papel, se encuentra con la mezcla de muestra, que comienza a subir por el papel con el solvente. Este papel está hecho de celulosa , una sustancia polar , y los compuestos dentro de la mezcla viajan más lejos si son menos polares. Las sustancias más polares se unen más rápidamente al papel de celulosa y, por tanto, no viajan tan lejos.
La cromatografía en capa fina (TLC) es una técnica de laboratorio ampliamente utilizada para separar diferentes productos bioquímicos en función de sus atracciones relativas a las fases estacionaria y móvil. Es similar a la cromatografía en papel . Sin embargo, en lugar de utilizar una fase estacionaria de papel, se trata de una fase estacionaria de una fina capa de adsorbente como gel de sílice , alúmina o celulosa sobre un sustrato plano e inerte . TLC es muy versátil; Se pueden separar varias muestras simultáneamente en la misma capa, lo que lo hace muy útil para aplicaciones de detección como pruebas de niveles de medicamentos y pureza del agua. [18]
La posibilidad de contaminación cruzada es baja ya que cada separación se realiza en una nueva capa. En comparación con el papel, tiene la ventaja de realizar tirajes más rápidos, mejores separaciones, mejores análisis cuantitativos y la posibilidad de elegir entre diferentes adsorbentes. Para obtener una resolución aún mejor y una separación más rápida que utiliza menos solvente, se puede utilizar TLC de alto rendimiento . Un uso popular más antiguo había sido diferenciar los cromosomas observando la distancia en el gel (la separación era un paso separado).
El principio básico de la cromatografía de desplazamiento es: una molécula con una alta afinidad por la matriz de cromatografía (el desplazador) compite eficazmente por los sitios de unión y, por lo tanto, desplaza a todas las moléculas con menores afinidades. [19] Existen claras diferencias entre la cromatografía de desplazamiento y de elución. En el modo de elución, las sustancias normalmente emergen de una columna en picos gaussianos estrechos. Para una máxima purificación se desea una amplia separación de los picos, preferiblemente hasta el valor inicial. La velocidad a la que cualquier componente de una mezcla desciende por la columna en modo de elución depende de muchos factores. Pero para que dos sustancias viajen a diferentes velocidades y, por tanto, se resuelvan, debe haber diferencias sustanciales en alguna interacción entre las biomoléculas y la matriz cromatográfica. Los parámetros operativos se ajustan para maximizar el efecto de esta diferencia. En muchos casos, la separación inicial de los picos sólo se puede lograr con elución en gradiente y cargas de columna bajas. Por lo tanto, dos inconvenientes de la cromatografía en modo de elución, especialmente a escala preparativa, son la complejidad operativa, debido al bombeo de disolvente en gradiente, y el bajo rendimiento, debido a las bajas cargas de la columna. La cromatografía de desplazamiento tiene ventajas sobre la cromatografía de elución en que los componentes se resuelven en zonas consecutivas de sustancias puras en lugar de "picos". Debido a que el proceso aprovecha la no linealidad de las isotermas, se puede separar una alimentación de columna más grande en una columna determinada con los componentes purificados recuperados en concentraciones significativamente más altas.
La cromatografía de gases (GC), también conocida a veces como cromatografía gas-líquido (GLC), es una técnica de separación en la que la fase móvil es un gas. La separación por cromatografía de gases siempre se lleva a cabo en una columna, que normalmente está "empaquetada" o "capilar". Las columnas empaquetadas son los caballos de batalla habituales de la cromatografía de gases, son más baratas y fáciles de usar y, a menudo, ofrecen un rendimiento adecuado. Las columnas capilares generalmente dan una resolución muy superior y, aunque son más caras, se están utilizando ampliamente, especialmente para mezclas complejas. Además, las columnas capilares se pueden dividir en tres clases: columnas tubulares abiertas de capa porosa (PLOT), columnas tubulares abiertas con revestimiento de pared (WCOT) y columnas tubulares abiertas con revestimiento de soporte (SCOT). Las columnas PLOT son únicas en el sentido de que la fase estacionaria se absorbe en las paredes de la columna, mientras que las columnas WCOT tienen una fase estacionaria que está unida químicamente a las paredes. Las columnas SCOT son en cierto modo una combinación de los dos tipos mencionados en el sentido de que tienen partículas de soporte adheridas a las paredes de la columna, pero esas partículas tienen una fase líquida unida químicamente a ellas. [20] Ambos tipos de columnas están fabricados con materiales no adsorbentes y químicamente inertes. El acero inoxidable y el vidrio son los materiales habituales para las columnas empaquetadas y el cuarzo o la sílice fundida para las columnas capilares.
La cromatografía de gases se basa en un equilibrio de partición del analito entre una fase estacionaria sólida o líquida viscosa (a menudo un material líquido a base de silicona) y un gas móvil (normalmente helio). La fase estacionaria se adhiere al interior de un tubo de vidrio o de sílice fundida de diámetro pequeño (comúnmente de 0,53 a 0,18 mm de diámetro interior) (una columna capilar) o a una matriz sólida dentro de un tubo de metal más grande (una columna empaquetada). Es muy utilizado en química analítica ; Aunque las altas temperaturas utilizadas en la GC lo hacen inadecuado para biopolímeros o proteínas de alto peso molecular (el calor los desnaturaliza), que se encuentran con frecuencia en bioquímica , es muy adecuado para su uso en los campos petroquímico , de monitoreo y remediación ambiental y de química industrial . También se utiliza ampliamente en la investigación química.
La cromatografía líquida (LC) es una técnica de separación en la que la fase móvil es un líquido. Se puede realizar tanto en columna como en plano. La cromatografía líquida actual, que generalmente utiliza partículas de relleno muy pequeñas y una presión relativamente alta, se denomina cromatografía líquida de alto rendimiento .
En HPLC, la muestra es forzada por un líquido a alta presión (la fase móvil) a través de una columna que está llena de una fase estacionaria compuesta de partículas de forma irregular o esférica, una capa monolítica porosa o una membrana porosa. Los monolitos son "medios cromatográficos similares a esponjas" [21] y están formados por un bloque interminable de partes orgánicas o inorgánicas. Históricamente, el HPLC se divide en dos subclases diferentes según la polaridad de las fases móvil y estacionaria. Los métodos en los que la fase estacionaria es más polar que la fase móvil (p. ej., tolueno como fase móvil, sílice como fase estacionaria) se denominan cromatografía líquida en fase normal (NPLC) y lo contrario (p. ej., mezcla de agua y metanol como fase móvil). fase y C18 (octadecilsililo) como fase estacionaria) se denomina cromatografía líquida de fase inversa (RPLC).
La cromatografía de fluidos supercríticos es una técnica de separación en la que la fase móvil es un fluido por encima y relativamente cerca de su temperatura y presión críticas.
Las técnicas específicas bajo este amplio título se enumeran a continuación.
La cromatografía de afinidad [22] se basa en la interacción selectiva no covalente entre un analito y moléculas específicas. Es muy específico, pero no muy robusto. [23] A menudo se utiliza en bioquímica en la purificación de proteínas unidas a etiquetas. Estas proteínas de fusión están marcadas con compuestos como etiquetas His , biotina o antígenos , que se unen específicamente a la fase estacionaria. Después de la purificación, estas etiquetas generalmente se eliminan y se obtiene la proteína pura.
La cromatografía de afinidad a menudo utiliza la afinidad de una biomolécula por los cationes de un metal (Zn, Cu, Fe, etc.). Las columnas suelen prepararse manualmente y podrían diseñarse específicamente para las proteínas de interés. Las columnas de afinidad tradicionales se utilizan como paso preparatorio para eliminar biomoléculas no deseadas o como paso principal en el análisis de una proteína con propiedades físicas desconocidas. [24]
Sin embargo, existen técnicas de cromatografía líquida que utilizan propiedades de cromatografía de afinidad. La cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) [25] [26] es útil para separar las moléculas antes mencionadas en función de la afinidad relativa por el metal. A menudo, estas columnas se pueden cargar con diferentes metales para crear una columna con una afinidad específica. [27]
La cromatografía de intercambio iónico (generalmente denominada cromatografía iónica) utiliza un mecanismo de intercambio iónico para separar analitos en función de sus respectivas cargas. Generalmente se realiza en columnas pero también puede resultar útil en modo plano. La cromatografía de intercambio iónico utiliza una fase estacionaria cargada para separar compuestos cargados, incluidos aniones , cationes , aminoácidos , péptidos y proteínas . En los métodos convencionales, la fase estacionaria es una resina de intercambio iónico que transporta grupos funcionales cargados que interactúan con grupos con carga opuesta del compuesto a retener. Hay dos tipos de cromatografía de intercambio iónico: intercambio catiónico e intercambio aniónico. En la cromatografía de intercambio catiónico la fase estacionaria tiene carga negativa y el ion intercambiable es un catión, mientras que en la cromatografía de intercambio aniónico la fase estacionaria tiene carga positiva y el ion intercambiable es un anión. [28] La cromatografía de intercambio iónico se usa comúnmente para purificar proteínas usando FPLC .
La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) también se conoce como cromatografía de permeación en gel (GPC) o cromatografía de filtración en gel y separa las moléculas según su tamaño (o más exactamente según su diámetro hidrodinámico o volumen hidrodinámico). Las moléculas más pequeñas pueden entrar en los poros del medio y, por tanto, quedan atrapadas y eliminadas del flujo de la fase móvil. El tiempo medio de residencia en los poros depende del tamaño efectivo de las moléculas del analito. Sin embargo, las moléculas que son más grandes que el tamaño de poro promedio del relleno se excluyen y, por lo tanto, esencialmente no sufren retención; estas especies son las primeras en eluir. Generalmente es una técnica de cromatografía de baja resolución y, por lo tanto, a menudo se reserva para el paso final de "pulido" de una purificación. También es útil para determinar la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de proteínas purificadas, especialmente porque se puede llevar a cabo en condiciones de solución nativa.
Una columna de adsorción cromatográfica de lecho expandido (EBA) para un proceso de separación bioquímica comprende un distribuidor de líquido de ecualización de presión que tiene una función de autolimpieza debajo de una placa de tamiz de bloqueo porosa en la parte inferior del lecho expandido, un conjunto de boquilla en la parte superior que tiene una función de limpieza de retrolavado. en la parte superior del lecho expandido, una mejor distribución del licor de materia prima agregado al lecho expandido asegura que el fluido que pasa a través de la capa de lecho expandido muestre un estado de flujo de pistón. La capa de lecho expandido muestra un estado de flujo de pistón. La columna de separación cromatográfica en lecho expandido tiene la ventaja de aumentar la eficiencia de separación del lecho expandido.
La cromatografía de adsorción en lecho expandido (EBA) es una técnica conveniente y eficaz para la captura de proteínas directamente de una muestra cruda no clarificada. En la cromatografía EBA, el lecho sedimentado se expande primero mediante un flujo ascendente de tampón de equilibrio. El alimento crudo, que es una mezcla de proteínas solubles, contaminantes, células y restos celulares, luego se hace pasar hacia arriba a través del lecho expandido. Las proteínas objetivo se capturan en el adsorbente, mientras que las partículas y los contaminantes pasan a través de él. Un cambio al tampón de elución mientras se mantiene el flujo ascendente produce la desorción de la proteína objetivo en modo de lecho expandido. Alternativamente, si se invierte el flujo, las partículas adsorbidas se asentarán rápidamente y las proteínas podrán ser desorbidas por un tampón de elución. El modo utilizado para la elución (lecho expandido versus lecho sedimentado) depende de las características del alimento. Después de la elución, el adsorbente se limpia con una solución de limpieza in situ (CIP) predefinida, y a la limpieza le sigue la regeneración de la columna (para uso posterior) o el almacenamiento.
La cromatografía de fase reversa (RPC) es cualquier procedimiento de cromatografía líquida en el que la fase móvil es significativamente más polar que la fase estacionaria. Se llama así porque en la cromatografía líquida de fase normal, la fase móvil es significativamente menos polar que la fase estacionaria. Las moléculas hidrófobas en la fase móvil tienden a adsorberse en la fase estacionaria relativamente hidrófoba. Las moléculas hidrofílicas en la fase móvil tenderán a eluir primero. Las columnas de separación normalmente comprenden una cadena de carbono C8 o C18 unida a un sustrato de partículas de sílice.
La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es una técnica analítica y de purificación que separa analitos, como proteínas, en función de interacciones hidrofóbicas entre ese analito y la matriz cromatográfica. Puede proporcionar un enfoque ortogonal no desnaturalizante para la separación de fases reversa, preservando las estructuras nativas y potencialmente la actividad proteica. En la cromatografía de interacción hidrófoba, el material de la matriz está ligeramente sustituido con grupos hidrófobos. Estos grupos pueden variar entre grupos metilo, etilo, propilo, butilo, octilo o fenilo. [29] En altas concentraciones de sal, las cadenas laterales no polares en la superficie de las proteínas "interactúan" con los grupos hidrofóbicos; es decir, ambos tipos de grupos quedan excluidos del disolvente polar (los efectos hidrófobos aumentan con el aumento de la fuerza iónica). Por lo tanto, la muestra se aplica a la columna en un tampón que es altamente polar, lo que genera una asociación de parches hidrofóbicos en el analito con la fase estacionaria. El eluyente suele ser un tampón acuoso con concentraciones de sal decrecientes, concentraciones crecientes de detergente (que interrumpe las interacciones hidrofóbicas) o cambios en el pH. De importancia crítica es el tipo de sal utilizada, ya que las sales más kosmotrópicas , según lo define la serie de Hofmeister, proporcionan la mayor estructuración de agua alrededor de la molécula y la presión hidrofóbica resultante. Para este fin se utiliza frecuentemente sulfato de amonio. La adición de disolventes orgánicos u otros componentes menos polares puede ayudar a mejorar la resolución.
En general, la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es ventajosa si la muestra es sensible al cambio de pH o a los disolventes fuertes que normalmente se utilizan en otros tipos de cromatografía, pero no a altas concentraciones de sal. Normalmente, lo que se varía es la cantidad de sal en el tampón. En 2012, Müller y Franzreb describieron los efectos de la temperatura sobre la HIC utilizando albúmina sérica bovina (BSA) con cuatro tipos diferentes de resina hidrofóbica. El estudio alteró la temperatura para afectar la afinidad de unión de BSA a la matriz. Se concluyó que la temperatura cíclica de 40 a 10 grados Celsius no sería adecuada para lavar eficazmente toda la BSA de la matriz, pero podría ser muy eficaz si la columna solo se usara unas pocas veces. [30] El uso de la temperatura para efectuar cambios permite a los laboratorios reducir los costos de compra de sal y ahorrar dinero.
Si se quieren evitar altas concentraciones de sal junto con fluctuaciones de temperatura, se puede usar un producto más hidrófobo para competir con la muestra y eluirla. Este método de HIC denominado independiente de la sal mostró un aislamiento directo de la inmunoglobulina G humana (IgG) del suero con un rendimiento satisfactorio y utilizó β-ciclodextrina como competidor para desplazar la IgG de la matriz. [31] Esto abre en gran medida la posibilidad de utilizar HIC con muestras que son sensibles a la sal, ya que sabemos que las altas concentraciones de sal precipitan las proteínas.
La cromatografía hidrodinámica (HDC) se deriva del fenómeno observado de que las gotas grandes se mueven más rápido que las pequeñas. [32] En una columna, esto sucede porque el centro de masa de las gotas más grandes no puede estar tan cerca de los lados de la columna como las gotas más pequeñas debido a su mayor tamaño general. [33] Las gotas más grandes eluirán primero desde el centro de la columna, mientras que las gotas más pequeñas se pegarán a los lados de la columna y eluirán al final. Esta forma de cromatografía es útil para separar analitos por masa molar (o masa molecular), tamaño, forma y estructura cuando se usa junto con detectores de dispersión de luz , viscosímetros y refractómetros . [34] Los dos tipos principales de HDC son el tubo abierto y la columna empaquetada . El tubo abierto ofrece tiempos de separación rápidos para partículas pequeñas, mientras que la columna empaquetada HDC puede aumentar la resolución y es más adecuada para partículas con una masa molecular promedio mayor que los daltons . [35] La HDC se diferencia de otros tipos de cromatografía porque la separación solo tiene lugar en el volumen intersticial, que es el volumen que rodea y entre las partículas en una columna empaquetada. [36]
La HDC comparte el mismo orden de elución que la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), pero los dos procesos aún varían en muchos aspectos. [35] En un estudio que compara los dos tipos de separación, Isenberg, Brewer, Côté y Striegel utilizan ambos métodos para la caracterización de polisacáridos y concluyen que la HDC junto con la dispersión de luz multiángulo (MALS) logra una distribución de masa molar más precisa en comparación con la dispersión de luz multiángulo (MALS). línea MALS que SEC en mucho menos tiempo. [37] Esto se debe en gran medida a que la SEC es una técnica más destructiva debido a que los poros de la columna degradan el analito durante la separación, lo que tiende a afectar la distribución de masa. [37] Sin embargo, la principal desventaja de la HDC es la baja resolución de los picos de los analitos, lo que hace que la SEC sea una opción más viable cuando se utiliza con productos químicos que no son fácilmente degradables y donde la elución rápida no es importante. [38]
HDC juega un papel especialmente importante en el campo de los microfluidos . El primer aparato exitoso para el sistema HDC en un chip fue propuesto por Chmela et al. en 2002. [39] Su diseño pudo lograr separaciones utilizando un canal de 80 mm de largo en una escala de tiempo de 3 minutos para partículas con diámetros que oscilaban entre 26 y 110 nm, pero los autores expresaron la necesidad de mejorar los parámetros de retención y dispersión . [39] En una publicación de 2010 de Jellema, Markesteijn, Westerweel y Verpoorte, la implementación de HDC con un flujo bidireccional de recirculación dio como resultado una separación basada en el tamaño de alta resolución con solo un canal de 3 mm de largo. [40] Tener un canal tan corto y una resolución tan alta se consideró especialmente impresionante teniendo en cuenta que estudios anteriores utilizaron canales de 80 mm de longitud. [39] Para una aplicación biológica, en 2007, Huh, et al. propusieron un dispositivo de clasificación de microfluidos basado en HDC y gravedad, que fue útil para evitar que partículas potencialmente peligrosas con un diámetro superior a 6 micrones ingresen al torrente sanguíneo al inyectar agentes de contraste en ultrasonidos . [41] Este estudio también logró avances para la sostenibilidad ambiental en microfluidos debido a la falta de componentes electrónicos externos que impulsen el flujo, lo que resultó ser una ventaja del uso de un dispositivo basado en la gravedad.
En algunos casos, la selectividad proporcionada por el uso de una columna puede ser insuficiente para proporcionar resolución de analitos en muestras complejas. La cromatografía bidimensional tiene como objetivo aumentar la resolución de estos picos mediante el uso de una segunda columna con diferentes propiedades físico-químicas ( clasificación química ). [42] [43] Dado que el mecanismo de retención en este nuevo soporte sólido es diferente de la separación en primera dimensión, puede ser posible separar compuestos mediante cromatografía bidimensional que son indistinguibles mediante cromatografía unidimensional. Además, la separación en la segunda dimensión ocurre más rápido que en la primera dimensión. [42] Un ejemplo de separación TDC es cuando la muestra se coloca en una esquina de una placa cuadrada, se revela, se seca al aire, luego se gira 90° y generalmente se vuelve a revelar en un segundo sistema de disolvente.
La cromatografía bidimensional se puede aplicar a separaciones por GC o LC. [42] [43] El enfoque desgarrador selecciona una región de interés específica en la primera dimensión para la separación, [44] y el enfoque integral utiliza todos los analitos en la separación de la segunda dimensión. [42] [43]
La técnica de lecho móvil simulado (SMB) es una variante de la cromatografía líquida de alta resolución; se utiliza para separar partículas y/o compuestos químicos que de otro modo serían difíciles o imposibles de resolver. Esta mayor separación se logra mediante una disposición de válvula y columna que se utiliza para alargar la fase estacionaria indefinidamente. En la técnica de lecho móvil de cromatografía preparativa, la entrada de alimentación y la recuperación del analito son simultáneas y continuas, pero debido a dificultades prácticas con un lecho en movimiento continuo, se propuso la técnica de lecho móvil simulado. En la técnica de lecho móvil simulado, en lugar de mover el lecho, las posiciones de entrada de la muestra y salida del analito se mueven continuamente, dando la impresión de un lecho móvil. La verdadera cromatografía en lecho móvil (TMBC) es sólo un concepto teórico. Su simulación, SMBC, se logra mediante el uso de una multiplicidad de columnas en serie y una compleja disposición de válvulas. Esta disposición de válvula proporciona alimentación de muestras y disolventes y salida de analitos y residuos en ubicaciones adecuadas de cualquier columna, por lo que permite cambiar a intervalos regulares la entrada de muestra en una dirección y la entrada de disolvente en la dirección opuesta, mientras se cambia la salida de analitos y residuos. posiciones apropiadamente también.
Pirólisis-cromatografía de gases-espectrometría de masas es un método de análisis químico en el que la muestra se calienta hasta su descomposición para producir moléculas más pequeñas que se separan mediante cromatografía de gases y se detectan mediante espectrometría de masas.
La pirólisis es la descomposición térmica de materiales en una atmósfera inerte o al vacío. La muestra se pone en contacto directo con un alambre de platino o se coloca en un tubo de muestra de cuarzo y se calienta rápidamente a 600-1000 °C. Dependiendo de la aplicación se utilizan temperaturas incluso más altas. En los pirolizadores reales se utilizan tres técnicas de calentamiento diferentes: horno isotérmico, calentamiento inductivo (filamento de punto Curie) y calentamiento resistivo con filamentos de platino. Las moléculas grandes se escinden en sus puntos más débiles y producen fragmentos más pequeños y volátiles. Estos fragmentos se pueden separar mediante cromatografía de gases. Los cromatogramas de pirólisis GC suelen ser complejos porque se forma una amplia gama de diferentes productos de descomposición. Los datos se pueden utilizar como huellas dactilares para demostrar la identidad del material o los datos de GC/MS se pueden utilizar para identificar fragmentos individuales para obtener información estructural. Para aumentar la volatilidad de los fragmentos polares, se pueden agregar varios reactivos de metilación a una muestra antes de la pirólisis.
Además del uso de pirolizadores dedicados, la GC de pirólisis de muestras sólidas y líquidas se puede realizar directamente dentro de inyectores de vaporizador de temperatura programable (PTV) que proporcionan un calentamiento rápido (hasta 30 °C/s) y temperaturas máximas altas de 600 a 650 °C. Esto es suficiente para algunas aplicaciones de pirólisis. La principal ventaja es que no es necesario comprar ningún instrumento específico y la pirólisis se puede realizar como parte del análisis de GC de rutina. En este caso, se deben utilizar revestimientos de entrada de GC de cuarzo. Se pueden adquirir datos cuantitativos y también se publican buenos resultados de derivatización dentro del inyector PTV.
La cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) es una forma de cromatografía líquida que se utiliza a menudo para analizar o purificar mezclas de proteínas. Como en otras formas de cromatografía, la separación es posible porque los diferentes componentes de una mezcla tienen diferentes afinidades por dos materiales, un fluido en movimiento (la "fase móvil") y un sólido poroso (la fase estacionaria). En FPLC, la fase móvil es una solución acuosa o "tampón". El caudal del buffer se controla mediante una bomba de desplazamiento positivo y normalmente se mantiene constante, mientras que la composición del buffer se puede variar extrayendo fluidos en diferentes proporciones de dos o más depósitos externos. La fase estacionaria es una resina compuesta de perlas, generalmente de agarosa reticulada , empaquetadas en una columna cilíndrica de vidrio o plástico. Las resinas FPLC están disponibles en una amplia gama de tamaños de perlas y ligandos de superficie según la aplicación.
La cromatografía a contracorriente (CCC) es un tipo de cromatografía líquido-líquido, donde tanto la fase estacionaria como la móvil son líquidas y la fase estacionaria líquida se mantiene estancada por una fuerte fuerza centrífuga. [45]
El principio de funcionamiento del instrumento CCC requiere una columna que consta de un tubo abierto enrollado alrededor de una bobina. La bobina gira en un movimiento giratorio de doble eje (cardioide), lo que hace que un campo de gravedad variable (G) actúe sobre la columna durante cada rotación. Este movimiento hace que la columna experimente un paso de partición por revolución y los componentes de la muestra se separen en la columna debido a su coeficiente de partición entre las dos fases líquidas inmiscibles utilizadas. Hay muchos tipos de CCC disponibles en la actualidad. Estos incluyen HSCCC (CCC de alta velocidad) y HPCCC (CCC de alto rendimiento). HPCCC es la versión más reciente y de mejor rendimiento de la instrumentación disponible actualmente.
En el instrumento CPC (cromatografía de partición centrífuga o cromatografía hidrostática en contracorriente), la columna consta de una serie de celdas interconectadas por conductos unidos a un rotor. Este rotor gira sobre su eje central creando el campo centrífugo necesario para mantener la fase estacionaria en su lugar. El proceso de separación en CPC se rige únicamente por la partición de solutos entre las fases estacionaria y móvil, cuyo mecanismo se puede describir fácilmente utilizando los coeficientes de partición ( KD ) de los solutos. Los instrumentos CPC están disponibles comercialmente para separaciones a escala de laboratorio, piloto y industrial con diferentes tamaños de columnas que van desde unos 10 mililitros hasta 10 litros de volumen.
A diferencia de la cromatografía en contracorriente (ver arriba), la cromatografía periódica en contracorriente (PCC) utiliza una fase estacionaria sólida y solo una fase móvil líquida. Por tanto, es mucho más similar a la cromatografía de afinidad convencional que a la cromatografía contracorriente. PCC utiliza múltiples columnas, que durante la fase de carga se conectan en línea. Este modo permite sobrecargar la primera columna de esta serie sin perder producto, que ya atraviesa la columna antes de que la resina esté completamente saturada. El producto innovador se captura en las columnas siguientes. En el siguiente paso se desconectan las columnas entre sí. La primera columna se lava y eluye, mientras las otras columnas todavía se están cargando. Una vez que la primera columna (inicialmente) se reequilibra, se vuelve a introducir en el flujo de carga, pero como última columna. Luego el proceso continúa de forma cíclica.
La cromatografía quiral implica la separación de estereoisómeros . En el caso de los enantiómeros, estos no tienen diferencias químicas ni físicas, aparte de ser imágenes especulares tridimensionales. Para permitir que se produzcan separaciones quirales, la fase móvil o la fase estacionaria deben volverse quirales, dando diferentes afinidades entre los analitos. Se encuentran disponibles comercialmente columnas de HPLC para cromatografía quiral (con una fase estacionaria quiral) tanto en fase normal como en fase reversa.
La cromatografía convencional es incapaz de separar mezclas racémicas de enantiómeros. Sin embargo, en algunos casos, las mezclas no racémicas de enantiómeros pueden separarse inesperadamente mediante cromatografía líquida convencional (por ejemplo, HPLC sin fase móvil quiral o fase estacionaria). [46] [47]
La cromatografía en fase normal acuosa (ANP) se caracteriza por el comportamiento de elución del modo de fase normal clásico (es decir, donde la fase móvil es significativamente menos polar que la fase estacionaria) en el que el agua es uno de los componentes del sistema disolvente de la fase móvil. Se distingue de la cromatografía líquida de interacción hidrófila (HILIC) en que el mecanismo de retención se debe a la adsorción en lugar de la partición. [48]
La cromatografía se utiliza en muchos campos, incluida la industria farmacéutica , la industria de alimentos y bebidas , la industria química , la ciencia forense , el análisis ambiental y los hospitales . [49]