La cromatografía bidimensional es un tipo de técnica cromatográfica en la que la muestra inyectada se separa al pasar por dos etapas de separación diferentes. Se conectan en secuencia dos columnas cromatográficas diferentes y el efluente del primer sistema se transfiere a la segunda columna. [1] Normalmente, la segunda columna tiene un mecanismo de separación diferente, de modo que las bandas que se resuelven mal en la primera columna pueden separarse por completo en la segunda columna. (Por ejemplo, una columna de cromatografía de fase inversa C18 puede ir seguida de una columna de fenilo). Alternativamente, las dos columnas pueden funcionar a diferentes temperaturas. Durante la segunda etapa de separación, la velocidad a la que se produce la separación debe ser más rápida que en la primera etapa, ya que sigue habiendo un solo detector. La superficie plana es susceptible de desarrollo secuencial en dos direcciones utilizando dos disolventes diferentes.
Las técnicas cromatográficas bidimensionales modernas se basan en los resultados de los primeros desarrollos de la cromatografía en papel y la cromatografía en capa fina (TLC), que implicaban fases móviles líquidas y fases estacionarias sólidas. Estas técnicas generarían posteriormente los análisis por cromatografía de gases (GC) y cromatografía de líquidos (LC) modernos . Diferentes combinaciones de GC y LC unidimensionales produjeron la técnica cromatográfica analítica que se conoce como cromatografía bidimensional.
La primera forma de cromatografía 2D se presentó en forma de una separación por TLC de varios pasos en la que primero se utiliza una lámina delgada de celulosa con un solvente en una dirección y luego, después de que el papel se haya secado, se hace pasar otro solvente en una dirección en ángulo recto con el primero. Esta metodología apareció por primera vez en la literatura con una publicación de 1944 de AJP Martin y colaboradores que detallaba un método eficiente para separar aminoácidos: "... pero el cromatograma bidimensional es especialmente conveniente, ya que muestra de un vistazo información que de otro modo solo se puede obtener como resultado de numerosos experimentos" (Biochem J., 1944, 38, 224).
Las separaciones bidimensionales se pueden llevar a cabo mediante cromatografía de gases o cromatografía de líquidos . Se han desarrollado varias estrategias de acoplamiento diferentes para "remuestrear" de la primera columna a la segunda. Algunos equipos importantes para las separaciones bidimensionales son el conmutador de Deans y el modulador, que transfieren selectivamente el eluyente de primera dimensión a la columna de segunda dimensión. [2]
La principal ventaja de las técnicas bidimensionales es que ofrecen un gran aumento en la capacidad de pico, sin requerir separaciones extremadamente eficientes en ninguna de las columnas. (Por ejemplo, si la primera columna ofrece una capacidad de pico (k 1 ) de 100 para una separación de 10 minutos, y la segunda columna ofrece una capacidad de pico de 5 (k 2 ) en una separación de 5 segundos, entonces la capacidad de pico combinada puede acercarse a k 1 × k 2 = 500, con el tiempo de separación total todavía ~ 10 minutos). Las separaciones 2D se han aplicado al análisis de gasolina y otras mezclas de petróleo, y más recientemente a mezclas de proteínas. [3] [4]
La espectrometría de masas en tándem (MS en tándem o MS/MS) utiliza dos analizadores de masas en secuencia para separar mezclas más complejas de analitos. La ventaja de la MS en tándem es que puede ser mucho más rápida que otros métodos bidimensionales, con tiempos que van desde milisegundos a segundos. [5] Debido a que no hay dilución con solventes en MS, hay menos probabilidad de interferencia, por lo que la MS en tándem puede ser más sensible y tener una relación señal-ruido más alta en comparación con otros métodos bidimensionales. La principal desventaja asociada con la MS en tándem es el alto costo de la instrumentación necesaria. Los precios pueden variar desde $500,000 a más de $1 millón. [6] Muchas formas de MS en tándem implican un paso de selección de masa y un paso de fragmentación. El primer analizador de masas se puede programar para que solo pase moléculas de una relación masa-carga específica. Luego, el segundo analizador de masas puede fragmentar la molécula para determinar su identidad. Esto puede ser especialmente útil para separar moléculas de la misma masa (es decir, proteínas de la misma masa o isómeros moleculares). Se pueden acoplar distintos tipos de analizadores de masas para lograr distintos efectos. Un ejemplo sería un sistema TOF - cuadrupolo . Los iones se pueden fragmentar y/o analizar secuencialmente en un cuadrupolo a medida que salen del TOF en orden creciente de m/z. Otro espectrómetro de masas en tándem muy utilizado es el analizador cuadrupolo-cuadrupolo-cuadrupolo (QQQ). El primer cuadrupolo se separa por masa, las colisiones tienen lugar en el segundo cuadrupolo y los fragmentos se separan por masa en el tercer cuadrupolo.
La cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) es una técnica de cromatografía bidimensional que combina la técnica de separación de la cromatografía de gases con la técnica de identificación de la espectrometría de masas . GC-MS es la herramienta analítica más importante para el análisis de compuestos orgánicos volátiles y semivolátiles en mezclas complejas. [7] Funciona inyectando primero la muestra en la entrada del GC donde se vaporiza y se empuja a través de una columna mediante un gas portador, normalmente helio. Los analitos de la muestra se separan en función de su interacción con el revestimiento de la columna, o la fase estacionaria, y el gas portador, o la fase móvil. [8] Los compuestos eluidos de la columna se convierten en iones a través del impacto electrónico (EI) o la ionización química (CI) antes de pasar por el analizador de masas. [9] El analizador de masas sirve para separar los iones en función de la masa a la carga. Las opciones populares realizan la misma función, pero difieren en la forma en que logran la separación. [10] Los analizadores que se utilizan normalmente con GC-MS son el analizador de masas de tiempo de vuelo y el analizador de masas cuadrupolo . [8] Después de salir del analizador de masas, los analitos llegan al detector y producen una señal que es leída por una computadora y utilizada para crear un cromatograma de gases y un espectro de masas. A veces, GC-MS utiliza dos cromatógrafos de gases en muestras particularmente complejas para obtener un poder de separación considerable y poder asignar de forma inequívoca las especies específicas a los picos apropiados en una técnica conocida como GCxGC-(MS). [11] En última instancia, GC-MS es una técnica utilizada en muchos laboratorios analíticos y es una herramienta analítica muy eficaz y adaptable.
La cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC/MS) combina la separación cromatográfica de alta resolución con la detección por MS. Como el sistema adopta la alta separación de la HPLC, los analitos que se encuentran en la fase móvil líquida suelen ionizarse mediante diversos métodos de ionización suave, entre ellos la ionización química a presión atmosférica (APCI), la ionización por electrospray (ESI) o la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI), que logra la ionización en fase gaseosa necesaria para el acoplamiento con la MS. [ cita requerida ] Estos métodos de ionización permiten el análisis de una gama más amplia de moléculas biológicas, incluidas aquellas con masas mayores, compuestos térmicamente inestables o no volátiles que la GC-MS normalmente no puede analizar.
La LC-MS proporciona una alta selectividad, ya que los picos no resueltos se pueden aislar seleccionando una masa específica. Además, también se logra una mejor identificación mediante espectros de masas y el usuario no tiene que depender únicamente del tiempo de retención de los analitos. Como resultado, la masa molecular y la información estructural, así como los datos cuantitativos, se pueden obtener mediante LC-MS. [9] Por lo tanto, la LC-MS se puede aplicar a varios campos, como la identificación y el perfil de impurezas en el desarrollo de fármacos y la fabricación farmacéutica, ya que la LC proporciona una separación eficiente de impurezas y la MS proporciona una caracterización estructural para el perfil de impurezas. [12]
Los disolventes comunes utilizados en la cromatografía líquida de fase normal o inversa, como el agua, el acetonitrilo y el metanol, son compatibles con la electroforesis en gel (ESI), pero un disolvente de grado LC puede no ser adecuado para la espectrometría de masas (MS). Además, se deben evitar los tampones que contienen iones inorgánicos, ya que pueden contaminar la fuente de iones. [13] No obstante, el problema se puede resolver mediante cromatografía líquida-MS 2D, así como otros problemas diversos, como la coelución de analitos y las respuestas de detección UV. [14]
La cromatografía líquida bidimensional (2D-LC) combina dos análisis separados de cromatografía líquida en un solo análisis de datos. La cromatografía líquida 2D moderna tiene sus orígenes a finales de la década de 1970 y principios de la de 1980. Durante este tiempo, los principios hipotéticos de la 2D-LC se estaban demostrando mediante experimentos realizados junto con trabajo conceptual y teórico complementario. Se demostró que la 2D-LC podía ofrecer un poder de resolución bastante mayor en comparación con las técnicas convencionales de cromatografía líquida unidimensional. En la década de 1990, la técnica de 2D-LC jugó un papel importante en la separación de sustancias y materiales extremadamente complejos que se encuentran en los campos de estudio de la proteómica y los polímeros. Desafortunadamente, se había demostrado que la técnica tenía una desventaja significativa en lo que respecta al tiempo de análisis. El trabajo inicial con 2D-LC se limitaba a una pequeña porción de separaciones de fase líquida debido al largo tiempo de análisis de la maquinaria. Las técnicas modernas de 2D-LC abordaron esa desventaja de frente y han reducido significativamente lo que alguna vez fue una característica perjudicial. La moderna cromatografía líquida 2D tiene una capacidad instrumental para realizar separaciones de alta resolución en una hora o menos. Debido a la creciente necesidad de instrumentación para realizar análisis de sustancias de creciente complejidad con mejores límites de detección, el desarrollo de la cromatografía líquida 2D avanza. Las piezas instrumentales se han convertido en un foco de atención de la industria y son mucho más fáciles de conseguir que antes. Antes de esto, la cromatografía líquida 2D se realizaba utilizando componentes de instrumentos 1D-LC y conducía a resultados de diversos grados tanto en exactitud como en precisión. La menor presión sobre la ingeniería instrumental ha permitido un trabajo pionero en el campo y la técnica de la cromatografía líquida 2D.
El objetivo de emplear esta técnica es separar mezclas que la cromatografía líquida unidimensional no puede separar de manera eficaz. La cromatografía líquida bidimensional es más adecuada para analizar muestras de mezclas complejas, como orina, sustancias ambientales y pruebas forenses, como sangre.
Las dificultades para separar mezclas se pueden atribuir a la complejidad de la mezcla en el sentido de que la separación no puede ocurrir debido a la cantidad de diferentes efluentes en el compuesto. Otro problema asociado con la cromatografía líquida unidimensional involucra la dificultad asociada con la resolución de compuestos estrechamente relacionados. Los compuestos estrechamente relacionados tienen propiedades químicas similares que pueden resultar difíciles de separar en función de la polaridad, la carga, etc. [15] La cromatografía líquida bidimensional proporciona una separación basada en más de una propiedad química o física. Usando un ejemplo de Nagy y Vekey, una mezcla de péptidos se puede separar en función de su basicidad, pero péptidos similares pueden no eluir bien. Usando una técnica de LC posterior, la basicidad similar entre los péptidos se puede separar aún más empleando diferencias en el carácter apolar. [16]
Como resultado, para poder separar mezclas de manera más eficiente, un análisis LC posterior debe emplear una selectividad de separación muy diferente en relación con la primera columna. Otro requisito para utilizar de manera efectiva la cromatografía líquida 2D, según Bushey y Jorgenson, es emplear técnicas altamente ortogonales, lo que significa que las dos técnicas de separación deben ser lo más diferentes posible. [17]
Existen dos clasificaciones principales de cromatografía líquida 2D. Estas incluyen: cromatografía líquida 2D integral (LCxLC) y cromatografía líquida 2D de corte central (LC-LC). [18] En la LC 2D integral, se muestrean completamente todos los picos de una elución de columna, pero se ha considerado innecesario transferir toda la muestra de la primera a la segunda columna. Una parte de la muestra se envía a los desechos mientras que el resto se envía a la válvula de muestreo. En la LC 2D de corte central, se seleccionan picos específicos y solo se inyecta una pequeña parte del pico en una segunda columna. La LC 2D de corte central ha demostrado ser bastante útil para el análisis de muestras de sustancias que no son muy complejas siempre que tengan un comportamiento de retención similar. En comparación con la LC 2D integral, la LC 2D de corte central proporciona una técnica eficaz con una configuración del sistema mucho menor y un costo operativo mucho menor. Se puede utilizar el corte de corazón múltiple (mLC-LC) para muestrear múltiples picos del análisis de primera dimensión sin correr el riesgo de una superposición temporal del análisis de segunda dimensión. [18] El corte de corazón múltiple (mLC-LC) utiliza una configuración de múltiples bucles de muestreo.
En el caso de la cromatografía líquida bidimensional (LC) la capacidad de pico es un aspecto muy importante. Esta se puede generar mediante la separación por elución en gradiente con una eficiencia mucho mayor que la separación isocrática , dada una cantidad de tiempo razonable. Si bien la elución isocrática es mucho más fácil en una escala de tiempo rápida, es preferible realizar una separación por elución en gradiente en la segunda dimensión. La intensidad de la fase móvil varía desde una composición de eluyente débil a una más fuerte. Con base en la teoría de la intensidad del disolvente lineal (LSST) de la elución en gradiente para la cromatografía en fase reversa, la relación entre el tiempo de retención, las variables instrumentales y los parámetros del soluto se muestra a continuación. [18]
Si bien se han realizado muchos trabajos pioneros en los años transcurridos desde que la cromatografía líquida 2D se convirtió en una importante técnica cromatográfica analítica, aún quedan muchos problemas modernos por considerar. Aún se deben decidir grandes cantidades de variables experimentales y la técnica se encuentra en constante desarrollo.
La cromatografía de gases bidimensional integral es una técnica analítica que separa y analiza mezclas complejas. Se ha utilizado en campos como: sabores, fragancias, estudios ambientales, productos farmacéuticos, productos derivados del petróleo y ciencia forense. La cromatografía de gases por cromatografía de gases proporciona un amplio rango de sensibilidad y produce un mayor poder de separación debido a la mayor capacidad de pico.