La cromatografía de capa fina de alto rendimiento ( HPTLC ) sirve como una extensión de la cromatografía de capa fina (TLC), ofreciendo robustez, simplicidad, velocidad y eficiencia en el análisis cuantitativo de compuestos. [1] Esta técnica analítica basada en TLC mejora la resolución de compuestos para análisis cuantitativos. Algunas de estas mejoras implican el empleo de placas TLC de mayor calidad con tamaños de partículas más finos en la fase estacionaria, lo que conduce a una resolución mejorada. [2] Además, la separación se puede refinar aún más mediante el desarrollo repetido de placas utilizando un dispositivo de desarrollo múltiple. Como resultado, HPTLC proporciona una resolución superior y un límite de detección (LOD) más bajo. [3]
Ventajas de HPTLC: [1]
HPTLC comprende tres modos: modo lineal, modo circular y modo anticircular. Entre estos modos, el modo anticircular destaca como el más rápido en teoría y práctica dentro del ámbito de HPTLC. Este modo logra la separación al permitir que la fase móvil entre en la capa de la placa con precisión a lo largo de una trayectoria circular exterior, después de lo cual fluye hacia el centro a una velocidad casi constante. Este enfoque maximiza la capacidad de la muestra y minimiza el consumo de tiempo, capas y fase móvil, lo que la convierte en la técnica HPTLC más rentable. La estrecha trayectoria puntual exclusiva del HPTLC anticircular facilita la cuantificación automatizada. En comparación con los modos lineal y circular, el modo anticircular demuestra una separación superior y una sensibilidad significativamente mayor, especialmente con valores de Rf más altos. [2]
Para comenzar HPTLC, se debe determinar una fase estacionaria para separar diferentes compuestos dentro de una mezcla. Alrededor del 90% de todas las separaciones farmacéuticas se realizan en gel de sílice en fase normal; sin embargo, se pueden usar otras fases estacionarias como la alúmina para muestras con compuestos disociables y celulosa para compuestos iónicos. [4] El método HPTLC de fase inversa (metodología similar a la TLC de fase inversa) se utiliza para compuestos con alta polaridad. Después de la selección de la fase estacionaria, las placas generalmente se lavan con metanol y se secan en un horno para eliminar el exceso de disolvente. [5]
La selección para la fase móvil es uno de los procesos más importantes de HPTLC y sigue un camino de "prueba y error". Sin embargo, el sistema ' PRISMA ' sirve como guía para encontrar la fase móvil óptima. [1] La fase móvil depende de la absortividad de la fase estacionaria y de la composición del compuesto de interés. [5] El compuesto se prueba primero con soluciones como éter dietílico , etanol , diclorometano , cloroformo para HPTLC de fase normal, o soluciones como metanol , acetonitrilo y tetrahidrofurano para HPTLC de fase inversa. Luego se analizan los factores de retardo ( R f) de los compuestos con el disolvente seleccionado y se elige el disolvente que proporciona el mayor R f como fase móvil del compuesto. Luego, la concentración del disolvente móvil se prueba frente a hexano (para HPTLC normal) y agua (para HPTLC de fase inversa) para determinar la necesidad de ajuste. [5] [6]
Los dispositivos HPTLC notables, como el Linomat 5 y el Automatic TLC Sampler 4 (ATS 4) de CAMAG, funcionan de manera muy similar al tener la técnica automatizada de aplicación de muestras por pulverización. [4] [5] Esta técnica automatizada de 'pulverización' es útil para superar la incertidumbre en el tamaño y la posición de las gotas cuando la muestra se aplica manualmente a la placa de TLC. Además, la automatización proporciona alta resolución y bandas estrechas, ya que el disolvente se evapora inmediatamente cuando la muestra entra en contacto con la placa. [4] Un enfoque para la automatización ha sido el uso de dispositivos piezoeléctricos e impresoras de inyección de tinta para aplicar la muestra. [7] Alternativamente, el Nanomat 4 y el ATS 4 de CAMAG se operan manualmente donde la muestra se aplica mediante aplicación puntual utilizando una pipeta capilar. [4] [5]
Tras la detección cromatográfica, las placas HPTLC generalmente se desarrollan en cámaras saturadas de doble canal con papel de filtro para obtener resultados óptimos. [5] [6] Sin embargo, las cámaras de fondo plano y las cámaras de desarrollo horizontal también se utilizan para compuestos específicos. Un mecanismo general para el dispositivo HPTLC es el siguiente. [5] Se coloca un papel de filtro ajustado en el canal trasero de la cámara y la fase móvil se vierte a través del canal trasero para asegurar la absorción completa del disolvente del papel de filtro. Luego, la cámara se inclina a ~45° para que ambos canales tengan el mismo volumen de disolvente y se dejan en paz para que se equilibren durante ~20 minutos. [5] Finalmente, la placa HPTLC se coloca en la cámara para revelar. Entre cada lectura de muestra, la fase móvil y el papel de filtro se cambian para garantizar los mejores resultados.
La capacidad puntual (análoga a la capacidad máxima en HPLC ) se puede aumentar revelando la placa con dos disolventes diferentes, utilizando cromatografía bidimensional . [8] El procedimiento comienza con el desarrollo de una placa cargada de muestra con el primer disolvente. Después de retirarla, la placa se gira 90° y se revela con un segundo disolvente.
HPTLC encuentra una amplia aplicación en diversos campos, incluidas las industrias farmacéutica, química clínica, química forense, bioquímica, cosmetología, análisis de alimentos y medicamentos, análisis ambiental y más, debido a sus numerosas ventajas. Se distingue por ser el único método cromatográfico capaz de presentar resultados como imágenes y ofrece simplicidad, rentabilidad, análisis paralelo de muestras, alta capacidad de muestras, resultados rápidos y la opción de múltiples métodos de detección.
El equipo de investigación de Le Roux evaluó el HPTLC para determinar los niveles séricos de salbutamol en ensayos clínicos y concluyó que es un método adecuado para analizar muestras de suero. [3]
HPTLC también se ha utilizado con éxito en la separación de varias subclases de lípidos, con resultados reproducibles y prometedores obtenidos para 20 subclases de lípidos diferentes. En diversas revistas se han publicado numerosos informes relacionados con estudios de medicina clínica. Como resultado, ahora se recomienda encarecidamente HPTLC para el análisis de fármacos en suero y otros tejidos. [7]