En biología molecular , el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ( RFLP ) es una técnica que explota variaciones en secuencias de ADN homólogas , conocidas como polimorfismos , poblaciones o especies, o para señalar la ubicación de genes dentro de una secuencia. El término puede referirse a un polimorfismo en sí mismo, detectado a través de las diferentes ubicaciones de los sitios de las enzimas de restricción , o a una técnica de laboratorio relacionada mediante la cual se pueden ilustrar tales diferencias. En el análisis RFLP , una muestra de ADN se digiere en fragmentos mediante una o más enzimas de restricción , y los fragmentos de restricción resultantes luego se separan mediante electroforesis en gel según su tamaño.
El análisis RFLP ahora está en gran medida obsoleto debido a la aparición de tecnologías de secuenciación de ADN económicas , pero fue la primera técnica de elaboración de perfiles de ADN lo suficientemente económica como para tener una aplicación generalizada. El análisis RFLP fue una herramienta temprana importante en el mapeo del genoma , la localización de genes para trastornos genéticos , la determinación del riesgo de enfermedad y las pruebas de paternidad .
La técnica básica para la detección de RFLP implica fragmentar una muestra de ADN con la aplicación de una enzima de restricción , que puede escindir selectivamente una molécula de ADN siempre que se reconozca una secuencia corta y específica en un proceso conocido como digestión de restricción . Los fragmentos de ADN producidos por la digestión luego se separan por longitud mediante un proceso conocido como electroforesis en gel de agarosa y se transfieren a una membrana mediante el procedimiento de transferencia Southern . La hibridación de la membrana con una sonda de ADN marcada determina entonces la longitud de los fragmentos que son complementarios a la sonda. Se dice que ocurre un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción cuando la longitud de un fragmento detectado varía entre individuos, lo que indica homologías de secuencia no idénticas. La longitud de cada fragmento se considera un alelo , contenga realmente una región codificante o no, y puede utilizarse en análisis genéticos posteriores.
Hay dos mecanismos comunes por los cuales puede variar el tamaño de un fragmento de restricción particular. En el primer esquema, una sonda de ADN detecta un pequeño segmento del genoma (línea más gruesa). En el alelo A , el genoma es escindido por una enzima de restricción en tres sitios cercanos (triángulos), pero la sonda solo detectará el fragmento más a la derecha. En el alelo a , el sitio de restricción 2 se ha perdido debido a una mutación , por lo que la sonda ahora detecta el fragmento fusionado más grande que va desde los sitios 1 al 3. El segundo diagrama muestra cómo se vería esta variación del tamaño del fragmento en una transferencia Southern y cómo cada alelo (dos por individuo) pueden heredarse entre miembros de una familia.
En el tercer esquema, la sonda y la enzima de restricción se eligen para detectar una región del genoma que incluye un segmento de repetición en tándem de número variable (VNTR) (cuadros en el diagrama esquemático). En el alelo c , hay cinco repeticiones en el VNTR y la sonda detecta un fragmento más largo entre los dos sitios de restricción. En el alelo d , sólo hay dos repeticiones en el VNTR, por lo que la sonda detecta un fragmento más corto entre los mismos dos sitios de restricción. Otros procesos genéticos, como inserciones , eliminaciones , translocaciones e inversiones , también pueden conducir a polimorfismos. Las pruebas RFLP requieren muestras de ADN mucho más grandes que las pruebas de repetición corta en tándem (STR).
El análisis de la variación del RFLP en los genomas era anteriormente una herramienta vital en el mapeo del genoma y el análisis de enfermedades genéticas. Si los investigadores intentaran determinar inicialmente la ubicación cromosómica de un gen de enfermedad en particular, analizarían el ADN de los miembros de una familia afectada por la enfermedad y buscarían alelos RFLP que mostraran un patrón de herencia similar al de la enfermedad (ver enlace genético ). Una vez que se localizó el gen de la enfermedad, el análisis RFLP de otras familias podría revelar quiénes estaban en riesgo de padecer la enfermedad o quiénes probablemente serían portadores de los genes mutantes. La prueba RFLP se utiliza en la identificación y diferenciación de organismos mediante el análisis de patrones únicos en el genoma. También se utiliza en la identificación de la tasa de recombinación en los loci entre sitios de restricción.
El análisis RFLP también fue la base de los primeros métodos de toma de huellas genéticas , útiles en la identificación de muestras recuperadas de la escena del crimen , en la determinación de la paternidad y en la caracterización de la diversidad genética o patrones de reproducción en poblaciones animales.
Sin embargo, la técnica para el análisis RFLP es lenta y engorrosa. Requiere una gran cantidad de muestra de ADN, y el proceso combinado de etiquetado de sondas, fragmentación de ADN, electroforesis, transferencia, hibridación, lavado y autorradiografía puede tardar hasta un mes en completarse. En 1985 se informó sobre una versión limitada del método RFLP que utilizaba sondas de oligonucleótidos. [1] Los resultados del Proyecto Genoma Humano han reemplazado en gran medida la necesidad de mapeo RFLP y la identificación de muchos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en ese proyecto. (así como la identificación directa de muchos genes y mutaciones de enfermedades) ha reemplazado la necesidad de un análisis de ligamiento de enfermedades por RFLP (consulte Genotipado de SNP ). El análisis de los alelos VNTR continúa, pero ahora generalmente se realiza mediante métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por ejemplo, los protocolos estándar para la toma de huellas dactilares de ADN implican análisis por PCR de paneles de más de una docena de VNTR.
RFLP todavía se utiliza en la selección asistida por marcadores. El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (TRFLP o, a veces, T-RFLP) es una técnica desarrollada inicialmente para caracterizar comunidades bacterianas en muestras de especies mixtas. La técnica también se ha aplicado a otros grupos, incluidos los hongos del suelo. TRFLP funciona mediante amplificación por PCR del ADN utilizando pares de cebadores marcados con etiquetas fluorescentes. Luego, los productos de la PCR se digieren utilizando enzimas RFLP y los patrones resultantes se visualizan utilizando un secuenciador de ADN. Los resultados se analizan simplemente contando y comparando bandas o picos en el perfil TRFLP, o haciendo coincidir bandas de una o más series de TRFLP con una base de datos de especies conocidas. Se han desarrollado varias herramientas de software diferentes para automatizar el proceso de coincidencia de bandas, comparación y base de datos de los perfiles TRFLP. [2]
La técnica es similar en algunos aspectos a la electroforesis en gel con gradiente de temperatura o con gradiente desnaturalizante (TGGE y DGGE).
Los cambios de secuencia directamente relacionados con un RFLP también se pueden analizar más rápidamente mediante PCR. La amplificación se puede dirigir a través del sitio de restricción alterado y los productos se pueden digerir con la enzima de restricción. Este método se ha denominado secuencia polimórfica amplificada escindida (CAPS). Alternativamente, el segmento amplificado se puede analizar mediante sondas de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO), un proceso que a menudo se puede realizar mediante una simple transferencia puntual .