La restricción de oligómeros (abreviada OR ) es un procedimiento para detectar una secuencia de ADN alterada en un genoma . Una sonda de oligonucleótido marcada se hibrida con un ADN objetivo y luego se trata con una enzima de restricción . Si la sonda coincide exactamente con el objetivo, la enzima de restricción escindirá la sonda y cambiará su tamaño. Sin embargo, si el ADN objetivo no coincide exactamente con la sonda, la enzima de restricción no tendrá ningún efecto sobre la longitud de la sonda. La técnica de quirófano, que ahora rara vez se realiza, estuvo estrechamente asociada con el desarrollo del popular método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En la parte 1a del esquema, la sonda oligonucleotídica, marcada en su extremo izquierdo (asterisco), se muestra en la línea superior. Es totalmente complementario a su ADN objetivo (aquí tomado del gen de la β-hemoglobina humana ), como se muestra en la siguiente línea. Parte de la sonda incluye el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Dde I (subrayado).
En la parte 1b, la enzima de restricción ha escindido la sonda y su objetivo (Dde I deja tres bases desapareadas en cada extremo). El extremo marcado de la sonda ahora tiene solo 8 bases de largo y se separa fácilmente mediante electroforesis en gel de la sonda sin cortar, que tenía 40 bases de largo.
En la parte 2, se muestra la misma sonda hibridada con un ADN objetivo que incluye una mutación de base única (en este caso, la mutación responsable de la anemia falciforme o SCA). El híbrido no coincidente ya no actúa como sitio de reconocimiento para la enzima de restricción y la sonda permanece en su longitud original.
La técnica de restricción de oligómeros se desarrolló como una variación del método de ensayo de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), con la esperanza de evitar el laborioso paso de transferencia Southern utilizado en el análisis RFLP. OR fue concebido por Randall Saiki y Henry Erlich a principios de la década de 1980, trabajando en Cetus Corporation en Emeryville, California . Fue patentado en 1984 [1] y publicado en 1985, [2] habiéndose aplicado a la mutación genómica responsable de la anemia falciforme . OR pronto fue reemplazada por la técnica más general de sondas de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO). [3]
El método de restricción de oligómeros se vio afectado por una serie de problemas:
A pesar de sus limitaciones, la técnica de OR se benefició de su estrecha asociación con el desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa. Kary Mullis , que también trabajaba en Cetus, había sintetizado las sondas de oligonucleótidos que estaban probando Saiki y Erlich. Consciente de los problemas que estaban encontrando, imaginó un método alternativo para analizar la mutación SCA que utilizaría componentes de la técnica de secuenciación del ADN de Sanger . Al darse cuenta de la dificultad de hibridar un cebador oligonucleotídico en una única ubicación del genoma, consideró utilizar un segundo cebador en la hebra opuesta. Luego generalizó ese proceso y se dio cuenta de que las extensiones repetidas de los dos cebadores conducirían a un aumento exponencial en el segmento de ADN entre los cebadores: una reacción en cadena de replicación catalizada por la ADN polimerasa . [4] [5]
Cuando Mullis encontró sus propias dificultades para demostrar la PCR , [6] se unió a un grupo existente de investigadores que estaban abordando los problemas con la OR. Juntos, desarrollaron el ensayo combinado PCR-OR. Así, la OR se convirtió en el primer método utilizado para analizar el ADN genómico amplificado por PCR.
Mullis también encontró dificultades para publicar la idea básica de la PCR (las revistas científicas rara vez publican conceptos sin resultados). Cuando su manuscrito para la revista Nature fue rechazado, la descripción básica de la PCR se añadió apresuradamente al artículo originalmente destinado a informar sobre el método OR (Mullis también fue coautor allí). Este artículo de OR [2] se convirtió así en la primera publicación de PCR y durante varios años se convertiría en el informe más citado por otros investigadores.