Un oligonucleótido específico de alelo ( ASO ) es un fragmento corto de ADN sintético complementario a la secuencia de un ADN diana variable. Actúa como una sonda para detectar la presencia de la diana en un ensayo de transferencia Southern o, más comúnmente, en el ensayo de transferencia puntual más simple . Es una herramienta común utilizada en pruebas genéticas , investigación forense y biología molecular .
Un ASO suele ser un oligonucleótido de 15 a 21 bases de nucleótidos de longitud. Está diseñado (y utilizado) de una manera que lo hace específico para una sola versión, o alelo , del ADN que se está analizando. [1] La longitud del ASO, la cadena de la que se elige y las condiciones mediante las cuales se une (y se lava del) ADN objetivo desempeñan un papel en su especificidad. Estas sondas generalmente pueden diseñarse para detectar una diferencia de tan solo 1 base en la secuencia genética del objetivo, una capacidad básica en el ensayo de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), importante en el análisis de genotipo y el Proyecto Genoma Humano . Para ser detectado después de que se haya unido a su objetivo, el ASO debe marcarse con una etiqueta radiactiva, enzimática o fluorescente. La tecnología del ensayo de metilación de Illumina aprovecha el ASO para detectar una diferencia de un par de bases (citosina frente a timina) para medir la metilación en un sitio CpG específico.
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La anemia de células falciformes, una enfermedad humana, es causada por una mutación genética en el codón del sexto aminoácido de la proteína sanguínea beta-hemoglobina . La secuencia normal de ADN GAG codifica el aminoácido glutamato , mientras que la mutación cambia la adenina media por una timina , dando lugar a la secuencia GTG (GUG en el ARNm ). Esta secuencia alterada sustituye una valina en la proteína final, distorsionando su estructura.
Para probar la presencia de la mutación en una muestra de ADN, se sintetizaría una sonda ASO para que sea complementaria a la secuencia alterada, [2] aquí etiquetada como "S". Como control, se sintetizaría otro ASO para la secuencia normal "A". Cada ASO es completamente complementario a su secuencia objetivo (y se unirá fuertemente), pero tiene un único desajuste con su alelo no objetivo (lo que lleva a una interacción más débil). El primer diagrama muestra cómo la sonda "S" es totalmente complementaria al objetivo "S" (arriba), pero no coincide parcialmente con el objetivo "A" (abajo).
Un segmento de los genes de beta-hemoglobina en el ADN de la muestra se amplificaría mediante PCR y los productos resultantes se aplicarían a membranas de soporte duplicadas como transferencias puntuales . Las cadenas de ADN de la muestra se separan con álcali y cada sonda ASO se aplica a una transferencia diferente. Después de la hibridación, se utiliza un protocolo de lavado que puede discriminar entre los híbridos completamente complementarios y los que no coinciden. Los ASO no coincidentes se eliminan de las transferencias, mientras que los ASO coincidentes (y sus etiquetas) permanecen.
En el segundo diagrama, se aplicaron seis muestras de ADN amplificado a cada una de las dos transferencias. La detección de la etiqueta ASO que queda tras el lavado permite una lectura directa del genotipo de las muestras, cada una con dos copias del gen de la beta-hemoglobina. Las muestras 1 y 4 solo tienen el alelo "A" normal, mientras que las muestras 3 y 5 tienen los alelos "A" y "S" (y, por tanto, son portadores heterocigotos de esta mutación recesiva ). Las muestras 2 y 6 tienen sólo el alelo "S" y se verían afectadas por la enfermedad. La pequeña cantidad de "hibridación cruzada" que se muestra es típica y se considera en el proceso de interpretación de los resultados finales.
El análisis ASO es sólo uno de los métodos utilizados para detectar polimorfismos genéticos. La secuenciación directa del ADN se utiliza para caracterizar inicialmente la mutación, pero es demasiado laboriosa para la detección de rutina. Un método anterior, el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), no necesitaba conocer el cambio de secuencia de antemano, pero requería que la mutación afectara el sitio de escisión de una enzima de restricción . El ensayo RFLP se adaptó brevemente al uso de sondas de oligonucleótidos , [3] pero esta técnica fue rápidamente suplantada por el análisis ASO del ADN amplificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La propia técnica de PCR ha sido adaptada para detectar polimorfismos, como la PCR específica de alelo . Sin embargo, la simplicidad y versatilidad del método combinado PCR/ASO ha llevado a su uso continuado, incluso con marcadores no radiactivos, y en un formato de "transferencia de puntos inverso" donde las sondas ASO se unen a la membrana y a la muestra de ADN amplificada. Se utiliza para la hibridación .
El uso de oligonucleótidos sintéticos como sondas específicas para variaciones de secuencias genéticas fue iniciado por R. Bruce Wallace, que trabajaba en el Centro Médico Nacional City of Hope en Duarte, California . En 1979, Wallace y sus compañeros de trabajo informaron sobre el uso de sondas ASO para detectar variaciones en un virus bacteriano monocatenario [4] y luego aplicaron la técnica a genes humanos clonados. En 1983 [5] y 1985 [2] el laboratorio de Wallace informó de la detección de la mutación de la anemia falciforme en muestras de ADN genómico completo, aunque esta aplicación se vio obstaculizada por la pequeña cantidad de etiqueta que podía llevar el ASO. [2]
Afortunadamente, en 1985 también se informó sobre la PCR, un método para amplificar en gran medida un segmento específico de ADN. [3] En menos de un año, la PCR se había combinado con el análisis ASO. [6] Esta combinación resolvió el problema del etiquetado ASO, ya que la cantidad de ADN objetivo podría amplificarse más de un millón de veces. Además, la especificidad del proceso de PCR en sí podría agregarse a la de las sondas ASO, reduciendo en gran medida el problema de la unión espuria del ASO a secuencias no objetivo. La combinación era lo suficientemente específica como para poder usarse en una simple transferencia Dot , evitando el laborioso e ineficaz método de transferencia Southern .
La ASO-PCR también se puede utilizar para detectar enfermedad residual mínima en cánceres de la sangre como el mieloma múltiple . [7]