En biología molecular , una sonda de hibridación ( HP ) es un fragmento de ADN o ARN , normalmente de 15 a 10.000 nucleótidos de longitud, que puede marcarse radiactiva o fluorescentemente . Los HP se pueden utilizar para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos en el ARN o ADN analizado que son complementarias a la secuencia de la sonda. [1] La sonda marcada primero se desnaturaliza (mediante calentamiento o en condiciones alcalinas , como exposición a hidróxido de sodio ) en ADN monocatenario (ADNss) y luego se hibrida con el ADNss ( transferencia Southern ) o ARN ( transferencia Northern ) objetivo inmovilizado en un membrana o in situ .
Para detectar la hibridación de la sonda con su secuencia diana, la sonda se etiqueta (o "marca") con un marcador molecular de moléculas radiactivas o (más recientemente) fluorescentes. Los marcadores comúnmente utilizados son el 32 P (un isótopo radiactivo del fósforo incorporado en el enlace fosfodiéster del ADN de la sonda), la digoxigenina , un marcador no radiactivo basado en anticuerpos , la biotina o la fluoresceína. Las secuencias de ADN o transcritos de ARN que tienen una similitud de secuencia de moderada a alta con la sonda se detectan luego visualizando la sonda hibridada mediante autorradiografía u otras técnicas de obtención de imágenes. Normalmente, se toman fotografías de rayos X del filtro o se coloca el filtro bajo luz ultravioleta. La detección de secuencias con similitud moderada o alta depende de cuán rigurosas se aplicaron las condiciones de hibridación: las condiciones de hibridación altas, como una temperatura de hibridación alta y un contenido bajo de sal en los tampones de hibridación, sólo permiten la hibridación entre secuencias de ácidos nucleicos que son muy similares, mientras que las rigurosas bajas, como como temperatura más baja y sal alta, permite la hibridación cuando las secuencias son menos similares.
Las sondas de hibridación utilizadas en micromatrices de ADN se refieren al ADN unido covalentemente a una superficie inerte, como portaobjetos de vidrio recubiertos o chips genéticos , con los que se hibrida una diana de ADNc móvil . Dependiendo del método , la sonda puede sintetizarse mediante el método de la fosforamidita o puede generarse y marcarse mediante amplificación por PCR o clonación (ambos son métodos más antiguos). Para aumentar la estabilidad in vivo de la sonda, no se utiliza ARN. En su lugar, se pueden utilizar análogos de ARN , en particular derivados de morfolino . Las sondas moleculares basadas en ADN o ARN se utilizan habitualmente en la detección de bibliotecas de genes, la detección de secuencias de nucleótidos con métodos de transferencia y en otras tecnologías genéticas, como microarrays de ácidos nucleicos y tejidos .
Dentro del campo de la ecología microbiana , las sondas de oligonucleótidos se utilizan con el fin de determinar la presencia de especies, géneros o microorganismos microbianos clasificados a un nivel más amplio, como bacterias , arqueas y eucariotas mediante hibridación fluorescente in situ (FISH). [2] Las sondas de ARNr han permitido a los científicos visualizar microorganismos, aún por cultivar en entornos de laboratorio, mediante la recuperación de secuencias de ARNr directamente del medio ambiente. [3] Ejemplos de estos tipos de microorganismos incluyen:
En algunos casos, la diferenciación entre especies puede resultar problemática cuando se utilizan secuencias de ARNr 16S debido a la similitud. En tales casos, el ARNr 23S puede ser una mejor alternativa. [6] La biblioteca estándar global de secuencias de ARNr crece constantemente y se actualiza continuamente, y por lo tanto, la posibilidad de un evento de hibridación aleatoria entre una sonda diseñada específicamente (basada en datos completos y actuales de una variedad de organismos de prueba) y una Un organismo objetivo no deseado/desconocido no se puede descartar fácilmente. [7] Por el contrario, es plausible que existan microorganismos, aún por identificar, que son filogenéticamente miembros de un grupo objetivo de sonda, pero que tienen sitios objetivo parciales o casi perfectos, lo que generalmente se aplica al diseñar sondas específicas de grupo.
Probablemente la mayor limitación práctica de esta técnica es la falta de automatización disponible. [8]
En la ciencia forense, las sondas de hibridación se utilizan, por ejemplo, para la detección de regiones con repeticiones cortas en tándem ( microsatélites ) [9] y en métodos de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ( RFLP ), todos los cuales se utilizan ampliamente como parte del análisis de perfiles de ADN .