La electroforesis en gel con gradiente de temperatura ( TGGE ) y la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante ( DGGE ) son formas de electroforesis que utilizan un gradiente químico o de temperatura para desnaturalizar la muestra a medida que se mueve a través de un gel de acrilamida . TGGE y DGGE se pueden aplicar a ácidos nucleicos como el ADN y el ARN y (con menos frecuencia) a las proteínas. TGGE se basa en cambios estructurales dependientes de la temperatura para separar los ácidos nucleicos . DGGE separa genes del mismo tamaño en función de su diferente capacidad desnaturalizante, que está determinada por la secuencia de sus pares de bases. DGGE fue la técnica original y TGGE un refinamiento de la misma.
DGGE fue inventado por Leonard Lerman , mientras era profesor en SUNY Albany. [1] [2] [3]
Se puede utilizar el mismo equipo para el análisis de proteínas , que fue realizado por primera vez por Thomas E. Creighton del Laboratorio de Biología Molecular MRC , Cambridge, Inglaterra. [4] Las proteínas y los ácidos nucleicos producen patrones de apariencia similares, pero los principios fundamentales son bastante diferentes.
El TGGE fue descrito por primera vez por Thatcher y Hodson [5] y por Roger Wartell de Georgia Tech. El grupo de Riesner en Alemania realizó un extenso trabajo. El equipo comercial para DGGE está disponible en Bio-Rad, INGENY y CBS Scientific; Biometra ofrece un sistema para TGGE.
El ADN tiene carga negativa y por eso se moverá hacia el electrodo positivo en un campo eléctrico. Un gel es una malla molecular, con agujeros aproximadamente del mismo tamaño que el diámetro de la cadena de ADN. Cuando se aplica un campo eléctrico, el ADN comenzará a moverse a través del gel, a una velocidad aproximadamente inversamente proporcional a la longitud de la molécula de ADN (las longitudes más cortas de ADN viajan más rápido); esta es la base para la separación dependiente del tamaño en la electroforesis estándar. .
En TGGE también hay un gradiente de temperatura a través del gel. A temperatura ambiente, el ADN existirá de forma estable en forma de doble cadena. A medida que aumenta la temperatura, las hebras comienzan a separarse ( fundirse ), y la velocidad a la que se mueven a través del gel disminuye drásticamente. Fundamentalmente, la temperatura a la que se produce la fusión depende de la secuencia (los pares de bases de GC son más estables que AT debido a las interacciones de apilamiento, no debido a la diferencia en los enlaces de hidrógeno [ cita necesaria ] (hay tres enlaces de hidrógeno entre un par de bases de citosina y guanina , pero sólo dos entre adenina y timina )), por lo que TGGE proporciona un "método dependiente de la secuencia e independiente del tamaño" para separar moléculas de ADN. TGGE separa moléculas y proporciona información adicional sobre el comportamiento de fusión y la estabilidad (Biometra, 2000).
La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) funciona aplicando una pequeña muestra de ADN (o ARN) a un gel de electroforesis que contiene un agente desnaturalizante . Los investigadores han descubierto que ciertos geles desnaturalizantes son capaces de inducir la fusión del ADN en varias etapas. Como resultado de esta fusión, el ADN se propaga a través del gel y se puede analizar en busca de componentes individuales, incluso aquellos tan pequeños como 200-700 pares de bases .
Lo que es único acerca de la técnica DGGE es que a medida que el ADN se somete a condiciones desnaturalizantes cada vez más extremas, las hebras fundidas se fragmentan completamente en hebras individuales. El proceso de desnaturalización en un gel desnaturalizante es muy nítido: "En lugar de fundirse parcialmente de forma continua como una cremallera, la mayoría de los fragmentos se funden en un proceso gradual. Porciones o dominios discretos del fragmento de repente se vuelven monocatenarios dentro de un proceso muy estrecho rango de condiciones desnaturalizantes" (Helms, 1990). Esto permite discernir diferencias en las secuencias de ADN o mutaciones de varios genes: las diferencias de secuencia en fragmentos de la misma longitud a menudo hacen que se fundan parcialmente en diferentes posiciones del gradiente y, por lo tanto, se "detengan" en diferentes posiciones del gel. Comparando el comportamiento de fusión de los fragmentos de ADN polimórficos uno al lado del otro en geles de gradiente desnaturalizante, es posible detectar fragmentos que tienen mutaciones en el primer dominio de fusión (Helms, 1990). Al colocar dos muestras una al lado de la otra en el gel y permitir que se desnaturalicen juntas, los investigadores pueden ver fácilmente incluso las diferencias más pequeñas en dos muestras o fragmentos de ADN.
Esta técnica tiene una serie de desventajas: "Los gradientes químicos como los utilizados en DGGE no son tan reproducibles, son difíciles de establecer y, a menudo, no resuelven completamente los heterodúplex " (Westburg, 2001). Estos problemas son abordados por TGGE, que utiliza un gradiente de temperatura, en lugar de un gradiente químico, para desnaturalizar la muestra.
Para separar ácidos nucleicos mediante TGGE se deben realizar los siguientes pasos: preparación y vertido de los geles, electroforesis, tinción y elución del ADN. Debido a que se debe elegir un sistema amortiguado , es importante que el sistema permanezca estable en el contexto de un aumento de temperatura. Por tanto, normalmente se utiliza urea para la preparación de geles; sin embargo, los investigadores deben ser conscientes de que la cantidad de urea utilizada afectará la temperatura general necesaria para separar el ADN. [6] Se carga el gel, se coloca la muestra sobre el gel según el tipo de gel que se esté procesando (es decir, paralelo o perpendicular), se ajusta el voltaje y se puede dejar que la muestra funcione. [6] Dependiendo del tipo de TGGE que se vaya a ejecutar, ya sea perpendicular o paralelo , es necesario preparar y cargar diferentes cantidades de muestra. Se utiliza una cantidad mayor de una muestra con TGGE perpendicular, mientras que con TGGE paralelo se utiliza una cantidad menor de muchas muestras. Una vez que se ha procesado el gel, se debe teñir el gel para visualizar los resultados. Si bien existen varios tintes que se pueden utilizar para este propósito, el teñido con plata ha demostrado ser la herramienta más eficaz. [6] El ADN se puede eluir de la tinción de plata para su posterior análisis mediante amplificación por PCR . [6]
TGGE y DGGE son ampliamente útiles en investigaciones biomédicas y ecológicas; Las aplicaciones seleccionadas se describen a continuación.
Según una investigación reciente realizada por Wong, Liang, Kwon, Bai, Alper y Gropman, [7] TGGE puede utilizarse para examinar el ADN mitocondrial de un individuo. Según estos autores, se utilizó TGGE para determinar dos nuevas mutaciones en el genoma mitocondrial : "Una mujer de 21 años de la que se sospechaba citopatía mitocondrial, pero con resultados negativos para mutaciones puntuales y deleciones del ADN mitocondrial común (ADNmt), fue examinada para mutaciones desconocidas en todo el genoma mitocondrial mediante electroforesis en gel con gradiente de temperatura". [8]
Lohr y compañeros de trabajo (2001) informan [ cita necesaria ] que en un estudio exhaustivo de las secreciones pancreáticas de personas sin carcinoma de páncreas , se pudieron encontrar mutaciones de p53 en los jugos pancreáticos de un pequeño porcentaje de participantes. Debido a que las mutaciones de p53 se han encontrado ampliamente en los carcinomas de páncreas, los investigadores de esta investigación intentaban determinar si la mutación en sí misma puede estar relacionada con el desarrollo del cáncer de páncreas. Si bien Lohr pudo encontrar mutaciones de p53 mediante TGGE en algunos sujetos, ninguno desarrolló posteriormente carcinoma de páncreas. Así, los investigadores concluyen señalando que la mutación p53 puede no ser el único indicador de la oncogénesis del carcinoma de páncreas.
La DGGE de genes codificantes de subunidades ribosómicas pequeñas fue descrita por primera vez por Gerard Muyzer, [9] mientras era postdoctoral en la Universidad de Leiden , y se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada en ecología microbiana.
La amplificación por PCR de ADN extraído de comunidades microbianas mixtas con cebadores de PCR específicos para fragmentos del gen 16S rRNA de bacterias y arqueas , y fragmentos del gen 18S rRNA de eucariotas da como resultado mezclas de productos de PCR. Debido a que todos estos amplicones tienen la misma longitud, no pueden separarse entre sí mediante electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, las variaciones de secuencia (es decir, diferencias en el contenido y la distribución de GC) entre diferentes ARNr microbianos dan como resultado diferentes propiedades de desnaturalización de estas moléculas de ADN.
Por lo tanto, los patrones de bandas DGGE se pueden utilizar para visualizar variaciones en la diversidad genética microbiana y proporcionar una estimación aproximada de la riqueza y abundancia de los miembros predominantes de la comunidad microbiana. Este método a menudo se conoce como toma de huellas dactilares comunitaria . Recientemente, varios estudios han demostrado que la DGGE de genes funcionales (por ejemplo, genes implicados en la reducción de azufre, la fijación de nitrógeno y la oxidación de amonio) puede proporcionar información sobre la función microbiana y la filogenia simultáneamente. Por ejemplo, Tabatabaei et al. (2009) aplicaron DGGE y lograron revelar el patrón microbiano durante la fermentación anaeróbica del efluente de la molienda de aceite de palma (POME) por primera vez. [10]