Los microfluidos basados en gotas manipulan volúmenes discretos de fluidos en fases inmiscibles con un número de Reynolds bajo y regímenes de flujo laminar . [1] [2] El interés en los sistemas de microfluidos basados en gotas ha aumentado sustancialmente en las últimas décadas. [3] [4] Las microgotas ofrecen la posibilidad de manejar volúmenes en miniatura (μL a fl) de fluidos de manera conveniente, proporcionan una mejor mezcla, encapsulación, clasificación, detección y son adecuadas para experimentos de alto rendimiento. [5] [1] Dos fases inmiscibles utilizadas para los sistemas basados en gotas se denominan fase continua (medio en el que fluyen las gotas) y fase dispersa (la fase de gotas). [6]
Para que se produzca la formación de gotas, se deben utilizar dos fases inmiscibles, denominadas fase continua (medio en el que se generan las gotas) y fase dispersa (la fase de las gotas). [6] El tamaño de las gotas generadas está controlado principalmente por la relación de caudal de la fase continua y la fase dispersa, la tensión interfacial entre dos fases y la geometría de los canales utilizados para la generación de gotas. [7] Las gotitas se pueden formar tanto de forma pasiva como activa. [8] La formación activa de gotas (eléctrica, magnética, centrífuga) a menudo utiliza dispositivos similares a la formación pasiva, pero requiere una entrada de energía externa para la manipulación de las gotas. [8] La formación pasiva de gotas tiende a ser más común que la activa, ya que produce resultados similares con diseños de dispositivos más simples. Generalmente, se utilizan tres tipos de geometrías de microfluidos para la generación pasiva de gotas: (i) flujo cruzado, (ii) enfoque de flujo y (iii) coflujo. [8] Los microfluidos basados en gotas a menudo funcionan con números de Reynolds bajos para garantizar el flujo laminar dentro del sistema. [2] El tamaño de las gotas a menudo se cuantifica con el coeficiente de variación (CV) como una descripción de la desviación estándar del tamaño medio de las gotas. Cada uno de los métodos enumerados proporciona una forma de generar gotas de microfluidos de manera controlable y sintonizable con una manipulación variable adecuada.
El flujo cruzado es un método de formación pasivo que involucra las fases continua y acuosa corriendo en ángulo entre sí. [9] Más comúnmente, los canales son perpendiculares en una unión en forma de T con la fase dispersa intersectando la fase continua; También son posibles otras configuraciones, como una unión en Y. [8] [11] [12] La fase dispersa se extiende hacia el continuo y se estira hasta que las fuerzas de corte rompen una gota. [13] [14] En una unión en T, el tamaño de la gota y la velocidad de formación están determinados por la relación del caudal y el número de capilares . [15] El número de capilaridad relaciona la viscosidad de la fase continua, la velocidad superficial de la fase continua y la tensión interfacial. [7] Normalmente, el caudal de la fase dispersa es más lento que el caudal continuo. La formación de uniones en T se puede aplicar aún más agregando canales adicionales, creando dos uniones en T en una ubicación. Al agregar canales, se pueden agregar diferentes fases dispersas en el mismo punto para crear gotas alternas de diferentes composiciones. [16] El tamaño de las gotas, generalmente superior a 10 μm, está limitado por las dimensiones del canal y a menudo produce gotas con un CV inferior al 2% con una velocidad de hasta 7 kHz.
El enfoque de flujo es un método de formación generalmente pasivo que involucra que la fase dispersa fluya para encontrarse con la fase continua generalmente en un ángulo (corrientes no paralelas) y luego sufre una restricción que crea una gota. [19] Esta restricción es generalmente un estrechamiento en el canal para crear la gota mediante un corte simétrico, seguido de un canal de igual o mayor ancho. [20] Al igual que con el flujo cruzado, el caudal de la fase continua suele ser mayor que el caudal de la fase dispersa. Disminuir el flujo de la fase continua puede aumentar el tamaño de las gotas. [5] El enfoque del flujo también puede ser un método activo en el que el punto de restricción se puede ajustar mediante cámaras laterales neumáticas controladas por aire comprimido. [21] Las cámaras móviles actúan para pellizcar el flujo, deformando la corriente y creando una gota con una frecuencia de conducción variable. El tamaño de las gotas suele ser de unos cientos de nanómetros con un CV inferior al 3% y una velocidad de hasta varios cientos de Hz a decenas de kHz. [8]
La coflujo es un método pasivo de formación de gotas en el que el canal de fase dispersa está encerrado dentro de un canal de fase continua. [22] Al final del canal de fase dispersa, el fluido se estira hasta que se rompe debido a las fuerzas de corte y forma gotas, ya sea por goteo o chorro. [23] El goteo ocurre cuando las fuerzas capilares dominan el sistema y se crean gotas en el punto final del canal. [23] El chorro se produce, al ensancharse o estirarse, cuando la fase continua se mueve más lentamente, creando una corriente a partir de la apertura del canal de fase dispersa. Bajo el régimen de ensanchamiento, la fase dispersa se mueve más rápido que la fase continua provocando una desaceleración de la fase dispersa, ensanchando la gota y aumentando el diámetro. [24] Bajo el régimen de estiramiento, domina el arrastre viscoso, lo que hace que la corriente se estreche y cree una gota más pequeña. [24] El efecto del caudal de fase continua sobre el tamaño de la gota depende de si el sistema está en un régimen de estiramiento o ensanchamiento, por lo que se deben usar diferentes ecuaciones para predecir el tamaño de la gota. [23] El tamaño de las gotas suele rondar varios cientos de nanómetros con un CV inferior al 5% y una velocidad de hasta decenas de kHz. [8]
Los beneficios de los microfluidos se pueden ampliar a un mayor rendimiento utilizando canales más grandes para permitir el paso de más gotas o aumentando el tamaño de las gotas. [25] El tamaño de las gotas se puede ajustar ajustando la velocidad de flujo de las fases continua y dispersa, pero el tamaño de las gotas está limitado por la necesidad de mantener la concentración, las distancias entre analitos y la estabilidad de las microgotas. [26] Por lo tanto, el aumento del tamaño del canal se vuelve atractivo debido a la capacidad de crear y transportar una gran cantidad de gotas, [25] aunque la dispersión [27] y la estabilidad de las gotas [28] se convierten en una preocupación. Finalmente, es necesario mezclar minuciosamente las gotas para exponer la mayor cantidad posible de reactivos para garantizar que reaccione la máxima cantidad de materiales de partida. [25] Esto se puede lograr mediante el uso de un canal ventoso para facilitar el flujo laminar inestable dentro de las gotas. [1]
Los tensioactivos desempeñan un papel importante en los microfluidos basados en gotas. [31] El objetivo principal del uso de un tensioactivo es reducir la tensión interfacial entre la fase dispersa (fase de gotitas, típicamente acuosa) y la fase continua (líquido portador, típicamente aceite) mediante la adsorción en las interfaces y evitando que las gotitas se fusionen entre sí. por lo tanto, estabiliza las gotas en un estado de emulsión estable , lo que permite tiempos de almacenamiento más prolongados en líneas de retardo, depósitos o viales. [31] [32] Sin el uso de tensioactivos, las emulsiones inestables eventualmente evolucionarán en fases separadas para reducir la energía general del sistema. [33] La química de la superficie no se puede ignorar en microfluidos, ya que la tensión interfacial se convierte en una consideración importante entre las gotas a microescala. [30] Linas Mazutis y Andrew D. Griffiths presentaron un método que utiliza tensioactivos para lograr una coalescencia selectiva y altamente controlable sin manipulación externa. [34] Manipulan el tiempo de contacto y la cobertura de surfactante interfacial de un par de gotas para controlar la fusión de las gotas. Cuanto mayor sea el porcentaje de diferencia de la cobertura de surfactante interfacial entre dos gotas, es menos probable que se produzca coalescencia. Este método permitió a los investigadores agregar reactivos a las gotas de una manera diferente y estudiar más a fondo la emulsificación. [34]
Los microfluidos se utilizan ampliamente para experimentos bioquímicos, por lo que es importante que los tensioactivos sean biocompatibles cuando se trabaja con células vivas y análisis de alto rendimiento. [35] [33] Los tensioactivos utilizados en dispositivos de investigación de células vivas no deben interferir con las reacciones bioquímicas o las funciones celulares. El aceite de hidrocarburo normalmente no se utiliza en la investigación de microfluidos celulares porque no es compatible con las células y daña la viabilidad celular. [36] El aceite de hidrocarburo también extrae moléculas orgánicas de la fase acuosa. [36] Sin embargo, los fluorosurfactantes con colas fluoradas, por ejemplo, se utilizan como emulsionantes de gotas compatibles que estabilizan las gotas que contienen células en su interior sin dañarlas ni alterarlas. [31] Los fluorosurfactantes son solubles en un aceite fluorado (fase continua) pero insolubles en la fase acuosa, lo que resulta en una disminución de la tensión interfacial acuosa-fluorada. [30] Por ejemplo, un tensioactivo de copolímero tribloque que contiene dos colas de perfluoropoliéter (PFPE) y un grupo de cabeza de bloque de polietilenglicol (PEG) es un fluorotensioactivo con gran biocompatibilidad y excelente estabilidad de las gotas contra la coalescencia. [35] [37] [38] Otro ejemplo son los poligliceroles lineales fluorados, que pueden funcionalizarse aún más en sus cadenas laterales adaptadas y son más personalizables en comparación con el copolímero basado en PEG. [39] Los tensioactivos se pueden comprar en muchas empresas químicas, como RainDance Technologies (ahora a través de BioRad) [32] y Miller-Stephenson. [35]
Tras la adición de tensioactivos o sales inorgánicas [41] a un sistema de microfluidos basado en gotas, la tensión interfacial de las gotas individuales se altera dentro del sistema de microfluidos. Estos componentes separativos permiten la utilización de las gotas como microrreactores para diversos mecanismos de procedimiento. [42] Para describir la relación entre la tensión interfacial (), la concentración de tensioactivos/sales disociados en la gota a granel ( C ), la temperatura ( T ), la constante de Boltzmann ( k B ) y la concentración de tensioactivos/sales disociados en la interfaz (Γ), se creó la isoterma de adsorción de Gibbs ; a la derecha se muestra una sección simplificada que resalta la información relevante.
Esta isoterma reafirma la noción de que mientras aumenta la concentración de sales inorgánicas, las sales se agotan de la interfaz de la gota (Γ<0) y la tensión de la interfaz de la gota aumenta. Esto contrasta con los tensioactivos, que se adsorben en la interfaz (Γ>0) y reducen la tensión interfacial [42] . A bajas concentraciones de tensioactivo, la tensión superficial disminuye según la isoterma de adsorción de Gibbs, hasta que se alcanza una determinada concentración, conocida como concentración micelar crítica (CMC), cuando las micelas comienzan a formarse. [43] Al alcanzar la CMC, la concentración de surfactante disuelto alcanza un máximo, donde los monómeros de surfactante se agregarán para formar micelas de tamaño nanométrico. [40] Debido a este potencial de formación de micelas, se pueden utilizar tres pasos al analizar la adsorción de los tensioactivos en la interfaz de la gota. [40] Primero, las moléculas de surfactante se adsorben entre la capa superficial y la capa subsuperficial. En segundo lugar, las moléculas se intercambian entre el subsuelo y la solución a granel. En tercer lugar, las micelas se relajan, provocada por la ruptura del equilibrio entre las moléculas libres y las micelas. [44] [45]
Las moléculas que componen cada micela se organizan dependiendo de la solución en la que están suspendidas, estando las porciones más solubles en contacto con la solución y las porciones menos solubles de la molécula en contacto entre sí. Dependiendo de la proporción de volumen de las cabezas polares y la cola apolar, se ha descubierto que varios tensioactivos forman agregados más grandes, [44] estructuras huecas de dos capas conocidas como vesículas . Un tensioactivo notable que se ha observado que forma vesículas es el AOT (sal sódica de dioctilsulfosuccinato). Estas micelas y vesículas son descubrimientos relativamente nuevos; sin embargo, se han utilizado para transportar agentes dentro de sistemas de microfluidos, [46] revelando aplicaciones futuras para los transportes de microfluidos. [47]
Las reacciones a microescala realizadas en aplicaciones basadas en gotas conservan los reactivos y reducen el tiempo de reacción, todo a velocidades de kilohercios. [5] [48] La adición de reactivos a los microrreactores de gotas ha sido un foco de investigación debido a la dificultad de lograr adiciones reproducibles a velocidades de kilohercios sin contaminación de gota a gota. [49]
Los reactivos se pueden agregar en el momento de la formación de gotas a través de una geometría de "coflujo". [1] Las corrientes de reactivo se bombean en canales separados y se unen en la interfaz con un canal que contiene la fase continua, que corta y crea gotas que contienen ambos reactivos. Al cambiar los caudales en los canales de reactivos, se pueden controlar las proporciones de reactivos dentro de una gota. [50] [51]
La fusión de gotitas con diferentes contenidos también se puede aprovechar para la adición de reactivos. La electrocoalescencia fusiona pares de gotitas mediante la aplicación de un campo eléctrico para desestabilizar temporalmente la interfaz gota-gota para lograr una fusión reproducible de gotitas en emulsiones estabilizadas con tensioactivos. [54] [55] La electrocoalescencia requiere que las gotas (que normalmente están separadas por la fase continua) entren en contacto. Al manipular el tamaño de las gotas en corrientes separadas, el flujo diferencial de tamaños de gotas puede hacer que las gotas entren en contacto antes de fusionarse. [11]
Otro método para facilitar la fusión de las gotas es la pinza acústica. [56] Mientras las gotas fluyen en canales de microfluidos, se pueden inmovilizar utilizando una pinza acústica basada en ondas acústicas superficiales . [56] Una vez que se sostiene una gota con la pinza acústica, las gotas consecutivas chocan contra ella y se produce la fusión.
Los métodos de coflujo de reactivos y fusión de gotas están vinculados a eventos de formación de gotas que carecen de flexibilidad posterior. Para desacoplar la adición de reactivo de la creación de gotas, se utiliza una configuración en la que la corriente de reactivo fluye a través de un canal perpendicular a la corriente de gotas. [60] [61] Luego, una gota de inyección se fusiona con el tapón a medida que pasa por el canal. El volumen de reactivo está controlado por el caudal del canal de reactivo perpendicular.
Uno de los primeros desafíos para tales sistemas es que la fusión de las gotas de reactivo no era reproducible para emulsiones estables. [59] Al adaptar el uso de un campo eléctrico accionado a esta geometría, Abate et al. logró un control subpicolitro de la inyección de reactivo. [59] Este enfoque, denominado picoinyección, controla el volumen de inyección a través de la presión de la corriente de reactivo y la velocidad de las gotas. Otros trabajos sobre este método han tenido como objetivo reducir las fluctuaciones de presión que impiden las inyecciones reproducibles. [62]
La inyección del fluido acuoso presurizado se produce cuando los electrodos se activan creando un campo eléctrico que desestabiliza la interfaz fluido acuoso/aceite, desencadenando la inyección. [59] Las ventajas clave de la picoinyección incluyen una baja transferencia involuntaria de material entre gotas y el mantenimiento de la compartimentación de las gotas a través de la inyección; sin embargo, los electrodos a menudo se fabrican usando soldadura metálica, lo que puede complicar la construcción del dispositivo microfluídico debido a un mayor tiempo de fabricación como resultado de una diseño más complejo. [58] [63] Un método de picoinyección alternativo implica la utilización del reactivo de inyección como conductor de un campo eléctrico donde un voltaje aplicado al fluido estimula la inyección. Un método de este tipo también permite un mayor control de la inyección ya que el voltaje aplicado corresponde al volumen de fluido reactivo inyectado. [63]
La contaminación gota a gota es un desafío para muchos métodos de inyección. [64] Para combatir esto, Doonan et al. desarrolló un canal K multifuncional, que hace fluir corrientes de reactivo en sentido opuesto al camino de la corriente de gotas. [65] Utilizando una interfaz entre los dos canales, la inyección se logra de manera similar a la picoinyección, pero cualquier contaminación bilateral se elimina mediante un flujo continuo de reactivo. Se evita la contaminación a expensas del posible desperdicio de reactivos valiosos.
Para que los microfluidos basados en gotas sean una técnica viable para llevar a cabo reacciones químicas o trabajar con células vivas a microescala, es necesario implementar métodos que permitan la incubación de gotas. [66] Las reacciones químicas a menudo necesitan tiempo para ocurrir, y las células vivas también requieren tiempo para crecer, multiplicarse y llevar a cabo procesos metabólicos . La incubación de gotas se puede realizar dentro del propio dispositivo (en el chip) o externamente (fuera del chip), según los parámetros del sistema. [48] La incubación fuera del chip es útil para tiempos de incubación de un día o más o para la incubación de millones de gotas a la vez. [48] La incubación en chip permite la integración de los pasos de detección y manipulación de gotas en un solo dispositivo. [48]
Las gotitas que contienen células se pueden almacenar fuera del chip en tubos de PTFE durante varios días mientras se mantiene la viabilidad celular y se permite la reinyección en otro dispositivo para su análisis. [67] Se ha informado de la evaporación de fluidos acuosos y oleosos durante el almacenamiento de gotas en tubos de PTFE, por lo que para el almacenamiento durante más de varios días, también se utilizan capilares de vidrio. [68] Finalmente, después de la formación en un dispositivo de microfluidos, las gotas también pueden guiarse a través de un sistema de capilares y tubos que conducen a una jeringa. Las gotas se pueden incubar en la jeringa y luego inyectarse directamente en otro chip para su posterior manipulación o detección y análisis. [69]
Las líneas de retardo se utilizan para incubar gotas en el chip. Después de la formación, las gotas se pueden introducir en un canal serpenteante con una longitud de hasta un metro o más. [71] [27] Aumentar la profundidad y el ancho del canal de la línea de retardo (en comparación con los canales utilizados para formar y transportar gotas) permite tiempos de incubación más prolongados y al mismo tiempo minimiza la contrapresión del canal . [27] Debido al mayor tamaño del canal, las gotas llenan el canal de la línea de retardo [72] y se incuban en el tiempo que les toma a las gotas atravesar este canal.
Las líneas de retardo se diseñaron originalmente para incubar gotas que contenían mezclas de reacciones químicas y eran capaces de lograr tiempos de retardo de hasta una hora. [27] [73] [74] Estos dispositivos utilizan canales de línea de retardo de decenas de centímetros de longitud. El aumento de la longitud total de los canales de la línea de retardo a uno o más metros hizo posibles tiempos de incubación de 12 horas o más. [71] [35] Se ha demostrado que las líneas de retardo mantienen la estabilidad de las gotas hasta por 3 días, [35] y se ha demostrado la viabilidad celular utilizando líneas de retardo en el chip por hasta 12 horas. [71] Antes del desarrollo de las líneas de retardo, la incubación en chip se realizaba dirigiendo gotas a grandes depósitos (varios milímetros tanto de largo como de ancho), lo que ofrece una alta capacidad de almacenamiento y una menor complejidad de construcción y operación del dispositivo si se controla el tiempo con precisión. de gotas no es necesario. [70]
Si es importante tener una distribución uniforme de los tiempos de incubación de las gotas, el canal de la línea de retardo puede contener constricciones regularmente espaciadas. [27] Las gotas que fluyen a través de un canal de diámetro uniforme viajan a diferentes velocidades según su posición radial; las gotas más cercanas al centro del canal se mueven más rápido que las que están cerca de los bordes. [27] Al reducir el ancho del canal a una fracción de su tamaño original, las gotas con velocidades más altas se ven obligadas a equilibrarse con las gotas que se mueven más lentamente porque la constricción permite que pasen menos gotas a la vez. [27] Otra manipulación de la geometría del canal de la línea de retardo implica introducir giros en la trayectoria de las gotas. Esto aumenta el grado en que los reactivos contenidos en las gotas se mezclan mediante advección caótica . [1] Para sistemas que requieren la incubación de 100 a 1000 gotas, se pueden fabricar trampas en el canal de la línea de retardo que almacenan las gotas por separado unas de otras. [75] [76] Esto proporciona un control y seguimiento más precisos de las gotas individuales.
El método micromagnetofluídico es el control de fluidos magnéticos mediante un campo magnético aplicado en una plataforma de microfluidos, [77] que ofrece control inalámbrico y programable de las gotas magnéticas. [78] Por lo tanto, la fuerza magnética también se puede utilizar para realizar diversas operaciones lógicas, además de la fuerza hidrodinámica y la fuerza de tensión superficial. La intensidad del campo magnético, el tipo de campo magnético (gradiente, uniforme o giratorio), la susceptibilidad magnética, la tensión interfacial , los caudales y las relaciones de caudal determinan el control de las gotas en una plataforma micromagnetofluídica. [79]
Las gotas magnéticas, en el contexto de los microfluidos basados en gotas, son gotas de tamaño de microlitros que están compuestas de ferrofluidos o contienen algún componente magnético que permite la manipulación mediante un campo magnético aplicado. Los ferrofluidos son mezclas homogéneas de soluciones coloidales de nanopartículas magnéticas en un vehículo líquido. [80] Dos aplicaciones de las gotas magnéticas son el control y la manipulación de gotas de microfluidos en un microambiente [81] [82] [83] [84] y la fabricación, transporte y utilización de construcciones de nanomateriales en las microgotas. [85] [86] [87] [88] [89] La manipulación de gotitas magnéticas se puede utilizar para realizar tareas como organizar las gotitas en una matriz ordenada para aplicaciones en estudios de cultivos celulares, mientras que el uso de gotitas magnéticas para la fabricación de nanoestructuras puede ser utilizado en aplicaciones de administración de medicamentos. [87]
En los sistemas de microfluidos tradicionales basados en gotas, es decir, una gota en un canal que contiene un aceite inmiscible que separa las gotas, el movimiento de las gotas se logra mediante diferencias de presión o tensión superficial. En sistemas de microfluidos no tradicionales basados en gotitas, como los aquí descritos, se necesitan otros mecanismos de control para manipular las gotitas. La aplicación de un campo magnético a una matriz de microfluidos que contiene gotitas magnéticas permite clasificar y organizar fácilmente las gotitas en patrones y configuraciones útiles. [83] [84] Estos tipos de manipulaciones se pueden lograr mediante la aplicación estática o dinámica de un campo magnético [82] que permite un alto grado de control sobre las gotas magnéticas. La caracterización del grado de control sobre las gotitas magnéticas incluye mediciones de la susceptibilidad magnética del ferrofluido, medición del cambio en la gotita en el área de interfaz del sustrato en presencia de un campo magnético aplicado y medición del "ángulo de caída" o la Ángulo en el que la gota se movería en presencia de un campo magnético cuando la superficie estuviera inclinada. [83] Las interacciones entre la gota de agua y la superficie se pueden manipular ajustando la estructura del propio sistema de microfluidos mediante la aplicación de un campo magnético al poli[dimetilsiloxano] (PDMS) dopado con hierro, un material común para dispositivos de microfluidos. [81]
En otros sistemas considerados sistemas de microfluidos no tradicionales basados en gotas, las microgotas magnéticas pueden ser un medio sencillo de fabricación y control de micro y nanomateriales, a veces llamados "robots". [82] Estas nanoestructuras están formadas por nanopartículas magnéticas en microgotitas que han sido manipuladas en estructuras específicas mediante un campo magnético aplicado. Las microhélices son una aplicación multifuncional de esta tecnología. Se generan gotas monodispersas que contienen nanopartículas magnéticas y se someten a un campo magnético que organiza las nanopartículas en una plantilla helicoidal que se fabrica in situ mediante polimerización fotoinducida. [86] Se demostró que estas microhélices son efectivas para limpiar canales que estaban bloqueados con compuestos semisólidos de grasas, aceites y proteínas, como los que se encuentran en las arterias. Se ha demostrado que las microhélices y los grupos de micropartículas en gotitas magnéticas son un medio de transporte para micropartículas pequeñas (500 μm de diámetro), lo que también muestra aplicaciones en la administración de fármacos. [86] [87] [89] También se han fabricado microestructuras no esféricas utilizando microfluidos magnéticos, lo que demuestra el minucioso control disponible. [85] Entre las microestructuras no esféricas que se fabricarían se encontraban microcápsulas de óxido de grafeno que podían aspirarse y volverse a inflar usando una micropipeta, al mismo tiempo que exhibían un comportamiento fotorresponsivo y magnetorresponsivo. [87] Las microcápsulas que responden a estímulos magnéticos y fotográficos, como las construidas con óxido de grafeno, son útiles para aplicaciones biomédicas que requieren manipulación in vivo y sin contacto de estructuras celulares como las células madre. [90]
La clasificación de gotas en microfluidos es una técnica importante que permite la discriminación basada en factores que van desde el tamaño de las gotas hasta las sustancias químicas etiquetadas con etiquetas fluorescentes dentro de la gota, que surge del trabajo realizado para clasificar las células en citometría de flujo . [91] [92] [93] [94] Dentro del ámbito de la clasificación de gotas hay dos tipos principales, la clasificación masiva, que utiliza métodos activos o pasivos, y la clasificación precisa, que se basa principalmente en métodos activos. La clasificación masiva se aplica a muestras con una gran cantidad de gotas (> 2000 s −1 ) que se pueden clasificar en función de las propiedades intrínsecas de las gotas (como viscosidad, densidad, etc.) sin verificar cada gota. [95] La clasificación precisa, por otro lado, tiene como objetivo separar las gotas que cumplen ciertos criterios que se verifican en cada gota. [95]
La clasificación pasiva se realiza mediante el control del diseño del canal de microfluidos, lo que permite la discriminación según el tamaño de las gotas. La clasificación por tamaño se basa en las uniones bifurcadas en el canal para desviar el flujo, lo que hace que las gotas se clasifiquen según cómo interactúan con la sección transversal de ese flujo, la velocidad de corte, que se relaciona directamente con su tamaño. [92] [96] [97] Otros métodos pasivos incluyen la inercia y la microfiltración, cada uno de los cuales tiene que ver con las propiedades físicas, como la inercia y la densidad, de la gota. [95] [98] La clasificación activa utiliza dispositivos adicionales conectados al dispositivo de microfluidos para alterar la trayectoria de una gota durante el flujo controlando algún aspecto, incluido el control térmico, magnético, neumático, acústico, hidrodinámico y eléctrico. [99] [100] [101] [102] Estos controles se utilizan para clasificar las gotitas en respuesta a alguna detección de señal de las gotitas, como la intensidad de la fluorescencia.
Los métodos de clasificación precisos utilizan estos métodos de clasificación activa tomando primero una decisión (por ejemplo, señal de fluorescencia) sobre las gotas y luego alterando su flujo con uno de los métodos antes mencionados. Se ha desarrollado una técnica llamada Clasificación de Gotas Activadas por Fluorescencia (FADS, por sus siglas en inglés) que utiliza clasificación activa inducida por un campo eléctrico con detección fluorescente para clasificar hasta 2000 gotas por segundo. [91] El método se basa, entre otros, en la actividad enzimática de células diana compartimentadas para activar un sustrato fluorogénico dentro de la gotita. Cuando se detecta una gota fluorescente, se encienden dos electrodos aplicando un campo a la gota, que cambia su curso hacia el canal de selección, mientras que las gotas no fluorescentes fluyen a través del canal principal hacia el desperdicio. [91] [32] Otros métodos utilizan diferentes criterios de selección, como la absorbancia o transmitancia de la gota, el número de partículas encapsuladas o el reconocimiento de imágenes de las formas celulares. [93] [94] [103] [104] Se puede realizar una clasificación para mejorar la pureza de la encapsulación, un factor importante para recolectar muestras para experimentos adicionales. [32]
Una de las ventajas clave de los microfluidos basados en gotas es la capacidad de utilizar gotas como incubadoras para células individuales. [67] [105]
Los dispositivos capaces de generar miles de gotas por segundo abren nuevas formas de caracterizar poblaciones celulares, no sólo basándose en un marcador específico medido en un momento específico, sino también en función del comportamiento cinético de las células, como la secreción de proteínas, la actividad enzimática o la proliferación. Recientemente, se encontró un método para generar una matriz estacionaria de gotitas microscópicas para la incubación de una sola célula que no requiere el uso de un surfactante . [ cita necesaria ]
Los sistemas de microfluidos basados en gotas proporcionan una plataforma analítica que permite el aislamiento de células individuales o grupos de células en gotas. [106] Esta herramienta ofrece un alto rendimiento para experimentos celulares, ya que los sistemas de microfluidos basados en gotas pueden generar miles de muestras (gotas) por segundo. En comparación con el cultivo celular en placas de microtitulación convencionales , las microgotas de volúmenes de μL a pL reducen el uso de reactivos y células. [107] Además, el manejo automatizado y el procesamiento continuo permiten que los ensayos se realicen de manera más eficiente. [107] El entorno aislado en una gotita encapsulada ayuda a analizar cada población celular individual. [105] Son adecuados los experimentos de cultivo celular de alto rendimiento, por ejemplo, probar el comportamiento de las bacterias, [108] encontrar tipos de células raras, [109] [110] la evolución dirigida, [51] y el cribado celular [73] [67]. para utilizar técnicas de microfluidos basadas en gotas.
El polidimetilsiloxano (PDMS) es el material más común para fabricar dispositivos de microfluidos debido a su bajo costo, facilidad de creación de prototipos y buena permeabilidad a los gases. [111] Junto con los aceites portadores de perfluorocarbono , que también permiten una buena permeabilidad a los gases, utilizados como fase continua en el sistema de microfluidos basado en gotas para el cultivo celular, algunos estudios han encontrado que la viabilidad celular es comparable al cultivo en matraces, por ejemplo, células de mamíferos. . [67] Para alcanzar el tiempo de cultivo requerido, se puede utilizar un depósito o una línea de retardo. El uso de un depósito permite un cultivo a largo plazo desde varias horas hasta varios días, mientras que la línea de retardo es adecuada para un cultivo a corto plazo con varios minutos. [51] [27] La incubación es factible tanto en el chip (depósito conectado con un sistema de microfluidos o líneas de retardo) [51] como fuera del chip (tubos de PTFE aislados con un sistema de microfluidos) [73] después de que se hayan formado las gotas. Después de la incubación, las gotas se pueden reinyectar en el dispositivo de microfluidos para su análisis. También existen sistemas de almacenamiento de gotas en chip especialmente diseñados para el análisis directo, como el dispositivo "dropspot", que almacena gotas en varias cámaras de matriz y utiliza un escáner de microarrays para el análisis directo. [112] [113]
El cultivo celular utilizando microfluidos basados en gotas ha creado muchas oportunidades para la investigación que son inaccesibles en plataformas convencionales, pero también plantea muchos desafíos. Algunos de los desafíos del cultivo celular en microfluidos basados en gotas son comunes a otros sistemas de cultivo de microfluidos. En primer lugar, se debe reevaluar el consumo de nutrientes para un sistema de microfluidos específico. Por ejemplo, el consumo de glucosa a veces aumenta en los sistemas de microfluidos (según el tipo de célula). [113] La renovación del medio es a veces más rápida que en el cultivo macroscópico debido a los volúmenes de cultivo reducidos, por lo que los volúmenes del medio utilizado deben ajustarse en cada línea celular y dispositivo. [113] En segundo lugar, la proliferación celular y el comportamiento pueden diferir dependiendo de los sistemas de microfluidos, un factor determinante es el área de la superficie de cultivo y el volumen del medio, que varían de un dispositivo a otro. Un informe encontró que la proliferación se vio afectada en los microcanales; el aumento de glucosa o la suplementación sérica no solucionaron el problema de su caso específico. [114] En tercer lugar, se debe controlar la regulación del pH. PDMS es más permeable al CO 2 que al O 2 o N 2 , por lo que el nivel de gas disuelto durante la incubación debe ajustarse para alcanzar la condición de pH esperada. [113]
También se han utilizado dispositivos basados en gotas para investigar las condiciones necesarias para la cristalización de proteínas. [115] [116]
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido una herramienta vital en la genómica y los esfuerzos biológicos desde sus inicios, ya que ha acelerado enormemente la producción y el análisis de muestras de ADN para una amplia gama de aplicaciones. [117] El avance tecnológico de la PCR a escala de microgotas ha permitido la construcción de un dispositivo de PCR en un chip de una sola molécula. [118] La replicación temprana del ADN de una sola molécula , incluido lo que ocurre en la PCR en microgotas o en emulsión, era más difícil que la PCR a mayor escala, por lo que generalmente se usaban concentraciones mucho más altas de componentes. [119] Sin embargo, las condiciones totalmente optimizadas han minimizado esta sobrecarga al garantizar que las moléculas individuales tengan una concentración adecuada de componentes de replicación distribuidos por toda la celda de reacción. [119] La PCR de microfluidos sin gotas también enfrenta desafíos con la absorción de reactivos en los canales del dispositivo, pero los sistemas basados en gotas disminuyen este problema con un menor contacto con los canales. [120]
Al utilizar sistemas de agua en aceite, la PCR de gotas funciona ensamblando ingredientes, formando gotas, combinando gotas, termociclando y luego procesando los resultados de manera muy similar a la PCR normal. Esta técnica es capaz de ejecutar más de 2 millones de reacciones de PCR, además de un aumento de 100.000 veces en la detección de alelos de tipo salvaje con respecto a los alelos mutantes . [121] La PCR basada en gotas aumenta en gran medida las capacidades de multiplexación de la PCR normal, lo que permite una producción rápida de bibliotecas de mutaciones. Sin revisión, la replicación del ADN es inherentemente algo propensa a errores, pero al introducir polimerasas propensas a errores , la PCR basada en gotas utiliza una producción de mutaciones superior a la normal para construir una biblioteca de mutaciones de forma más rápida y eficiente de lo normal. [122] Esto hace que la PCR basada en gotas sea más atractiva que la PCR tradicional, más lenta. [123] En una aplicación similar, se ha desarrollado una PCR de microgotas altamente multiplexada que permite la detección de un gran número de secuencias objetivo, lo que permite aplicaciones como la identificación bacteriana. [124] La PCR en chip permite un exceso de multiplexación de 15 x 15, lo que significa que se pueden ejecutar múltiples secuencias de ADN objetivo en el mismo dispositivo al mismo tiempo. [125] Esta multiplexación fue posible con fragmentos de cebadores de ADN inmovilizados colocados en la base de los pocillos individuales de los chips. [126]
La combinación de la PCR basada en gotas con dispositivos de polidimetilsiloxano (PDMS) ha permitido mejoras novedosas de la PCR en gotas, además de remediar algunos problemas preexistentes con la PCR en gotas, incluida la alta pérdida de líquido debido a la evaporación. [127] La PCR basada en gotas es muy sensible a las burbujas de aire, ya que crean diferencias de temperatura que dificultan la replicación del ADN y al mismo tiempo desalojan los reactivos de la cámara de replicación. [120] Ahora, la PCR basada en gotas se ha llevado a cabo en dispositivos PDMS para transferir reactivos en gotas a través de una capa de PDMS de una manera más controlada que mantiene mejor el progreso y la estabilidad de la replicación que las válvulas tradicionales. [128] Un dispositivo PDMS de PCR en gotas reciente permitió una mayor precisión y amplificación de números de copias pequeños en comparación con los experimentos de PCR cuantitativos tradicionales. [129] Esta mayor precisión se debió al PDMS dopado con surfactante, así como a un diseño de dispositivo intercalado de vidrio, PDMS y vidrio. Estas propiedades del dispositivo han permitido un cebado más optimizado del ADN y una menor evaporación de agua durante el ciclo de PCR. [129]
Para la secuenciación del ADN se han utilizado múltiples sistemas de microfluidos, incluidos sistemas basados en gotas .
La evolución dirigida de una enzima es un proceso repetitivo de creación de mutaciones genéticas aleatorias, detección de un fenotipo objetivo y selección de las variantes más robustas para su posterior modificación. [130] La capacidad de la humanidad para utilizar la evolución dirigida para optimizar enzimas con fines biotecnológicos está limitada en gran medida por el rendimiento de las herramientas y métodos de detección y la simplicidad de su uso. Debido a la naturaleza iterativa de la evolución dirigida y la necesidad de grandes bibliotecas, la evolución dirigida a macroescala puede ser una tarea costosa. [131] [132] Como tal, realizar experimentos a microescala mediante microfluidos basados en gotas proporciona una alternativa significativamente más barata que los equivalentes macroscópicos. [132] Varios enfoques valoran la evolución dirigida a través de microfluidos de gotas en menos de 40 dólares para una pantalla de una biblioteca de genes de tamaño 10 6 –10 7 , mientras que el experimento a macroescala correspondiente tiene un precio de aproximadamente 15 millones de dólares. [131] [133] Además, con tiempos de detección que oscilan entre 300 y 2000 gotas clasificadas por segundo, los microfluidos basados en gotas proporcionan una plataforma para la detección de bibliotecas significativamente acelerada, de modo que las bibliotecas de genes de 10 7 se pueden clasificar bien en un día. [132] [133] [93] Los dispositivos de microfluidos basados en gotas hacen que la evolución dirigida sea accesible y rentable.
Se han desarrollado muchos enfoques diferentes para la construcción de dispositivos de microfluidos basados en gotas para la evolución dirigida con el fin de tener la capacidad de detectar una amplia variedad de proteínas, vías y genomas diferentes. [131] Un método para introducir bibliotecas en el dispositivo de microfluidos utiliza la encapsulación de una sola célula, en la que las gotas contienen un máximo de una célula cada una. Esto evita resultados confusos que podrían generarse al tener múltiples células y, en consecuencia, múltiples genotipos, en una sola gota, al tiempo que se maximiza la eficiencia del consumo de recursos. [134] [135] Este método permite la detección de proteínas secretadas y proteínas en la membrana celular. La adición de un lisado celular a las gotitas, que descompone la membrana celular de manera que las especies intracelulares estén libremente disponibles dentro de la gotita, amplía las capacidades del método de encapsulación de células individuales para analizar proteínas intracelulares. [136] [137] La biblioteca también se puede crear completamente in vitro (es decir, no en su contexto biológico/celular) de modo que el contenido de la gotita sea exclusivamente una cadena de ADN mutada. El sistema in vitro requiere PCR y el uso de sistemas de transcripción y traducción in vitro (IVTT) para generar la proteína deseada en la gotita para su análisis. [133] La clasificación de gotas para evolución dirigida se realiza principalmente mediante detección de fluorescencia (p. ej., clasificación de gotas activada por fluorescencia (FADS)), [138] sin embargo, desarrollos recientes en métodos de clasificación basados en absorbancia, conocidos como clasificación de gotas activada por absorbancia ( AADS), [93] han ampliado la diversidad de sustratos que pueden sufrir una evolución dirigida a través de un dispositivo de microfluidos basado en gotas. [132] [133] [93] [138] Recientemente, la capacidad de clasificación incluso se ha ampliado a la detección de niveles de NADPH y se ha utilizado para crear oxidorreductasas dependientes de NADP de mayor actividad . [139] En última instancia, el potencial de diferentes métodos de creación y análisis de gotas en dispositivos de microfluidos basados en gotas de evolución dirigida permite una variabilidad que facilita una gran población de candidatos potenciales para la evolución dirigida.
Como método de ingeniería de proteínas, la evolución dirigida tiene muchas aplicaciones en campos que van desde el desarrollo de fármacos y vacunas hasta la síntesis de alimentos y productos químicos. [140] Se desarrolló un dispositivo de microfluidos para identificar huéspedes mejorados de producción de enzimas (es decir, fábricas de células) que pueden emplearse industrialmente en diversos campos. [134] Una aldolasa artificial se mejoró aún más 30 veces utilizando microfluidos basados en gotas para que su actividad se pareciera a la de las proteínas naturales. [141] Más recientemente, la creación de oxidasas funcionales ha sido posible gracias a un novedoso dispositivo de microfluidos creado por Debon et al. [142] El enfoque de microfluidos basado en gotas para la evolución dirigida tiene un gran potencial para el desarrollo de una gran variedad de nuevas proteínas.
Desde principios de la década de 2000, los avances en microfluidos basados en gotas la han convertido en una técnica poderosa para realizar campañas de evolución dirigida. Los primeros desarrollos en la producción a granel de emulsiones simples (SE; por ejemplo, gotas de "agua en aceite") y emulsiones dobles (DE; por ejemplo, gotas de "agua en aceite en agua") fueron seguidos por innovaciones en formación de chips y clasificación de SE y DE, que permiten una mayor facilidad y rendimiento de experimentos de evolución dirigida en chips de microfluidos. [143]
Un componente esencial de la evolución dirigida es el mantenimiento del vínculo entre genotipos y fenotipos enzimáticos. [130] La capacidad de formar DE en el chip y posteriormente clasificarlos mediante clasificación de células activadas por fluorescencia ( FACS ) impulsó el campo hacia adelante. En 2013, Yan et al. mostró el uso de FACS para clasificar DE. [144] En 2014, Zinchenko et al. publicaron un sistema para formular DE monodispersos y clasificarlos y analizarlos cuantitativamente utilizando un citómetro de flujo disponible comercialmente. Los autores demostraron el poder de su sistema enriqueciendo una arilsulfatasa activa de tipo salvaje de poblaciones de 0,1% y 0,01% de células activas entre 800 y 2500 veces, respectivamente. [145] En 2016, Larsen et al. desarrolló un sistema de clasificación óptica basado en fluorescencia para monitorear la actividad de las polimerasas dentro de un dispositivo de microfluidos. Utilizando su sistema, Larsen y sus colegas demostraron un enriquecimiento de aproximadamente 1200 veces de una polimerasa diseñada. Después de una ronda de selección de una polimerasa de ácido nucleico alfa-L-treofuranosil (TNA), demostraron una mejora de aproximadamente 14 veces en la actividad y una colocación correcta de >99% de los residuos en un polipéptido en crecimiento. [146] En 2017, SS Terekhov et al. desarrollaron una clasificación de emulsión doble de agua en aceite en agua (MDE) de microfluidos monodispersos, que combinaron con FACS seguido de cromatografía líquida-espectrometría de masas ( LC-MS ) y secuenciación de próxima generación ( NGS ). Los autores demostraron una separación de alta sensibilidad de células de levadura enzimáticamente activas a partir de células inactivas mediante fluorescencia. Además, mostraron la capacidad de su sistema MDE-FACS para interrogar las interacciones entre las células diana y efectoras dentro de las gotitas sin interferencia de otras células bacterianas y de levadura. [147]
En lugar de desarrollar nuevas plataformas, algunos grupos se han centrado en la optimización de métodos, herramientas y plataformas existentes para simplificar y mejorar su facilidad de uso por parte de no expertos. En 2017, Sukovitch et al. creó un sistema para producir DE monodispersos o de tamaño aproximadamente igual eliminando el proceso de recubrimiento requerido para los chips de DE. [148] Varios grupos han alterado los tipos y concentraciones de tensioactivos para simplificar la administración de reactivos en SE y DE. [149] [150] [151] En 2018, Ma et al. presentó un sistema de detección de gotas de microfluidos de doble canal (DMDS). El sistema utiliza etiquetas fluorogénicas para clasificar los SE según dos propiedades diferentes de una enzima objetivo al mismo tiempo. Utilizando DMDS, Ma y sus compañeros de trabajo dirigieron la evolución de una esterasa altamente enantioselectiva utilizando múltiples propiedades enzimáticas. [152] En 2020, Brower et al. demostró la clasificación y el aislamiento DE en un chip seguido de FACS que permite un alto rendimiento de clasificación de células de mamíferos encapsuladas, de las cuales posteriormente se puede extraer el material genético. [153] [154]
Si bien el etiquetado fluorogénico es una herramienta poderosa para el seguimiento y la clasificación, no siempre es compatible con los sistemas de microfluidos basados en gotas y el diseño experimental. Recientemente se han informado nuevas técnicas de detección sin etiquetas y no basadas en fluorescencia. [143] En 2016, Gielen et al. publicó un dispositivo de microfluidos de clasificación de gotas activadas por absorbancia (AADS) y demostró su funcionalidad dirigiendo la evolución de una fenilalanina deshidrogenasa. [155] En 2016, Sun et al. demostró el uso de gotitas de SE y MS de alto rendimiento para detectar activadores e inhibidores de enzimas mediante la detección de una biblioteca de transaminasas. [156] [157] En 2019, Pan et al. mostró la clasificación de gotas por tensiones interfaciales, que se ven afectadas por el contenido de las gotas. [158] En 2020, Haidas et al. presentó un enfoque de microfluidos que utiliza espectrometría de masas por ionización y desorción láser asistida por matriz ( MALDI -MS) y microscopía de fluorescencia, que los autores utilizaron para medir la concentración y actividad de fitasa, respectivamente, en células de levadura. [159] En 2020, Holland-Moritz et al. publicaron su método de clasificación de gotas activadas en masa (MADS), que integra el análisis de MS con la clasificación de gotas activadas por fluorescencia (FADS). Con este método, las gotas se dividen y analizan por separado tanto mediante MS como FADS. El poder de este método se demostró mediante la detección de la actividad de una biblioteca de transaminasas expresada in vitro . [160]
Los expertos anticipan que las futuras innovaciones basadas en microfluidos para campañas de evolución dirigida se impulsarán en el espacio comercial, lo que dará como resultado métodos y herramientas más simples y menos costosos que puedan aplicarse a enzimas biotecnológicamente relevantes. [161]
Los microfluidos basados en gotas se han convertido en una herramienta importante en la síntesis química debido a varias características atractivas. Las reacciones a microescala permiten la reducción de costos mediante el uso de pequeños volúmenes de reactivos, reacciones rápidas del orden de milisegundos y una transferencia de calor eficiente que genera beneficios ambientales cuando la cantidad de energía consumida por unidad de aumento de temperatura puede ser extremadamente pequeña. [162] El grado de control sobre las condiciones locales dentro de los dispositivos a menudo hace posible seleccionar un producto sobre otro con alta precisión. [162] [163] Con una alta selectividad de producto y tamaños pequeños de reactivos y entornos de reacción, la limpieza de la reacción es menos estricta y el espacio que ocupa es menor. [162] Las gotas microdispersas creadas mediante química basada en gotas son capaces de actuar como entornos en los que se producen reacciones químicas, como portadores de reactivos en el proceso de generación de nanoestructuras complejas . [164] Las gotitas también son capaces de transformarse en estructuras similares a células que pueden usarse para imitar los componentes y procesos biológicos de los humanos. [164] [163]
Como método de síntesis química , las gotas en los dispositivos de microfluidos actúan como cámaras de reacción individuales protegidas de la contaminación a través de la contaminación del dispositivo por la fase continua. Los beneficios de la síntesis utilizando este régimen (en comparación con los procesos por lotes) incluyen alto rendimiento , experimentos continuos, bajo desperdicio, portabilidad y un alto grado de control sintético. [164] Algunos ejemplos de posibles síntesis son la creación de microesferas semiconductoras [165] y nanopartículas . [166] La detección química está integrada en el dispositivo para garantizar un seguimiento cuidadoso de las reacciones; se utilizan espectroscopia de RMN , microscopía , detección electroquímica y detección quimioluminiscente . A menudo, se toman medidas en diferentes puntos a lo largo del dispositivo de microfluidos para controlar el progreso de la reacción. [164]
Se observa una mayor velocidad de reacciones usando microgotitas en la reacción aldólica de silil enol éteres y aldehídos . Utilizando un dispositivo de microfluidos basado en gotas , los tiempos de reacción se redujeron a veinte minutos, frente a las veinticuatro horas necesarias para un proceso por lotes. [26] Otros experimentadores pudieron mostrar una alta selectividad del cistilbeno al trans-estilbeno termodinámicamente favorecido en comparación con la reacción discontinua, lo que demuestra el alto grado de control proporcionado por las gotas del microrreactor. Este estereocontrol es beneficioso para la industria farmacéutica. [167] Por ejemplo, el L- metotrexato , un fármaco utilizado en quimioterapia, se absorbe más fácilmente que el isómero D.
La fabricación de cristales líquidos ha sido un punto de intriga durante más de cinco décadas [168] por sus propiedades anisotrópicas . Los dispositivos microfluídicos se pueden utilizar para la síntesis de cristales líquidos colestéricos confinados mediante la estratificación de múltiples capas en forma de conchas que consisten en diferentes emulsiones de aceite en agua y agua en aceite. [169] La construcción de cristales líquidos encapsulados a través del flujo microfluídico de gotitas de cristal líquido en un aceite inmiscible permite un espesor y una composición de la capa de emulsión monodispersa nunca antes vistos antes de la llegada de las técnicas de microfluidos. La llegada de la tecnología de cristal líquido ha llevado a avances en las pantallas ópticas utilizadas tanto en investigación como en productos de marca de consumo, pero descubrimientos más recientes han abierto la puerta a la combinación de fotones y conversión ascendente, así como a sensores ópticos para analitos biológicos. [170]
Las partículas avanzadas y los materiales a base de partículas, como partículas poliméricas, microcápsulas , nanocristales y grupos o perlas de cristales fotónicos, se pueden sintetizar con la ayuda de microfluidos basados en gotas. [171] Las nanopartículas , como las nanopartículas núcleo-cubierta de CdS coloidal y CdS/CdSe, también se pueden sintetizar mediante múltiples pasos en una escala de tiempo de milisegundos en un sistema basado en gotas de microfluidos. [172]
Las nanopartículas, micropartículas y grupos coloidales en dispositivos de microfluidos son útiles para funciones como la administración de fármacos. [173] Las primeras partículas incorporadas en sistemas basados en gotas fueron geles de sílice en el rango de tamaño micrométrico para probar sus aplicaciones en la fabricación de pantallas y recubrimientos ópticos. [174] La mezcla de partículas sólidas con microgotitas acuosas requiere cambios en los canales de microfluidos, como mezclas de reactivos adicionales y la elección de materiales específicos como sílice o polímeros que no interfieran con los canales y cualquier sustancia bioactiva que contengan las gotitas. [ cita necesaria ]
La síntesis de copolímeros requiere moler moléculas macroscópicas hasta convertirlas en micropartículas con superficies porosas e irregulares utilizando disolventes orgánicos y técnicas de emulsificación. Estas gotas precargadas con micropartículas también se pueden procesar rápidamente mediante irradiación UV. [175] La caracterización de estas micropartículas y nanopartículas implica microimágenes para analizar la estructura y la identificación del material macroscópico que se está moliendo. Técnicas como la encapsulación controlada de burbujas de gas individuales para crear nanopartículas huecas para sintetizar microburbujas con contenidos específicos son vitales para los sistemas de administración de fármacos. Tanto las micropartículas a base de sílice como las de titanio se utilizan como cubiertas duraderas después de usar gas para aumentar la velocidad del flujo de la fase acuosa. Una mayor velocidad de flujo permite un mayor control sobre el espesor de las capas acuosas. [ cita necesaria ] La versatilidad emergente de las nanopartículas se puede ver en la administración de microgotitas cargadas de partículas que se utilizan en inyecciones de depósito para la administración de medicamentos en lugar del enfoque típico de inyectar drogas por vía intravenosa . Esto es posible debido al bajo espesor de las carcasas, que normalmente se encuentran en el intervalo de 1 a 50 µm. [ cita necesaria ]
Los avances más recientes en partículas de microfluidos permitieron la síntesis de partículas de tamaño nanométrico a partir de polímeros de origen biológico. Utilizando diseños multifásicos de enfoque de flujo específicos que controlan el caudal y la temperatura, se puede controlar el tamaño de la formación de nanopartículas junto con la concentración y configuración de las gotas. [175] [176] Otra técnica para crear microgotas cargadas de partículas es el uso de nanopartículas de hidrogel de lípidos que se pueden manipular en gotas de forma más estrecha, lo cual es útil cuando se deben usar materiales blandos o quebradizos. [177] Estos materiales blandos son especialmente importantes en la producción de polvos . Se están produciendo avances recientes a nanoescala, como dispositivos que fabrican gotas esféricas y no esféricas que son ultrarrápidas y mezcladas de manera homogénea, para la producción a gran escala de partículas en polvo en aplicaciones industriales. [178]
Las nanopartículas monodispersas también son de gran interés en la fabricación de catalizadores . La eficiencia de muchos sistemas catalíticos heterogéneos depende de altas áreas superficiales de partículas de metales de transición. [179] Se han utilizado técnicas de microfluidos para fabricar nanopartículas de oro mediante la interacción interfacial de gotitas que contienen cloruro de oro, hexano y un agente reductor con una fase acuosa circundante. Este proceso también puede controlar tanto el tamaño como la forma de las nanopartículas/nanohojas con precisión y alto rendimiento [180] en comparación con otros métodos como la deposición física de vapor .
Se ha demostrado que el uso de gotitas que contienen diversos materiales como sílice o metales de transición como el oro, fluyedas a través de una fase oleosa inmiscible, es eficaz para controlar tanto el tamaño de las nanopartículas como el tamaño de los poros, lo que permite diseñar dispositivos eficientes de captura de gases absorbentes. [181] y catalizadores heterogéneos. Se han sintetizado nanopartículas monodispersas de oro y plata utilizando gotitas de cloruro de oro y plata a las que se les ha dosificado un agente reductor para romper los enlaces metal-ligando, lo que lleva a la aglomeración de nanopartículas metálicas monodispersas que pueden filtrarse fácilmente para eliminarlas de la solución. [182]
La síntesis de partículas de gel, también conocidas como hidrogeles, microgeles y nanogeles, ha sido un área de interés tanto para los investigadores como para las industrias durante las últimas décadas. [183] Un enfoque basado en microfluidos para sintetizar estas partículas de hidrogel es una herramienta útil, debido al alto rendimiento, la monodispersidad de las partículas y la reducción de costos mediante el uso de pequeños volúmenes de reactivos. Uno de los desafíos clave al principio en el campo de los geles fue la formación de partículas monodispersas. Inicialmente se utilizaron técnicas basadas en polimerización para formar micropartículas en masa de tamaño polidisperso. [184] [185] [186] [187] Estas técnicas generalmente se centraban en el uso de una solución acuosa que se mezclaba vigorosamente para crear emulsiones. Finalmente, se desarrolló una técnica para crear microgeles biodegradables monodispersos mediante la elaboración de emulsiones O/W en una geometría de canal generadora de gotas en línea. [188] Esta geometría de unión acompañada de una fase continua cargada de surfactante fue responsable de la creación de microgeles hechos de poli-dex-HEMA. Otras geometrías de dispositivos, incluida la formación de estilo de unión en T, también son viables y se han utilizado para fabricar geles a base de sílice. [189]
Una vez establecidos estos métodos, los esfuerzos se centraron en aplicar funcionalidad a estas partículas. Los ejemplos incluyen partículas encapsuladas de bacterias, partículas encapsuladas de fármacos o proteínas y partículas de gel magnético. [190] Insertar estos componentes funcionales en la estructura del gel puede ser tan simple como integrar el componente en la fase dispersa. En algunos casos, se prefieren determinadas geometrías de dispositivos; por ejemplo, se utilizó una unión de enfoque de flujo para encapsular bacterias en micropartículas de agarosa. [191] Las emulsiones múltiples son de interés para aplicaciones farmacéuticas y cosméticas [192] y se forman utilizando dos uniones consecutivas de enfoque de flujo. [193] También se pueden sintetizar partículas más complicadas, como las partículas de Janus, que tienen superficies con dos o más propiedades físicas distintas. [194]
Algunos ejemplos de la aplicación cada vez mayor de partículas de gel incluyen la administración de fármacos, aplicaciones biomédicas e ingeniería de tejidos, y muchas de estas aplicaciones requieren partículas monodispersas donde se prefiere un enfoque basado en microfluidos. [195] [196] Sin embargo, los métodos de emulsificación a granel siguen siendo relevantes, ya que no todas las aplicaciones requieren micropartículas uniformes. El futuro de la síntesis de geles microfluídicos puede residir en el desarrollo de técnicas para crear cantidades masivas de estas partículas uniformes con el fin de hacerlas más disponibles comercial e industrialmente. [197]
Los desarrollos recientes en microfluidos de gotas también han permitido la síntesis in situ de fibras de hidrogel que contienen gotas acuosas con morfología controlada. [198] Las fibras de hidrogel proporcionan una opción intrigante de material biocompatible para la administración de fármacos y la bioimpresión de materiales que pueden imitar el comportamiento de una matriz extracelular. Este método de microfluidos se diferencia de la ruta tradicional de síntesis por hilado en húmedo mediante el uso de gotitas acuosas en una corriente de aceite inmiscible en lugar de la extrusión de una solución a granel de la misma composición mezclada fuera del sitio. [199] La capacidad de controlar el tamaño, el caudal y la composición de las gotas proporciona una opción para ajustar la morfología de las fibras para adaptarlas a un uso específico en bioanálisis y emulación de funciones anatómicas. [200]
La extracción líquido-líquido es un método utilizado para separar un analito de una mezcla compleja; Con este método, los compuestos se separan en función de su solubilidad relativa en diferentes fases líquidas inmiscibles. [201] [202] Para superar algunas de las desventajas asociadas con los métodos de mesa comunes, como el método del matraz agitado, [203] Se han empleado métodos de extracción líquido-líquido microfluídicos. Los sistemas microfluídicos basados en gotas han demostrado la capacidad de manipular volúmenes discretos de fluidos en fases inmiscibles con números de Reynolds bajos. [204] y regímenes de flujo laminar. [5] Los métodos a microescala reducen el tiempo necesario, reducen el volumen de muestras y reactivos y permiten la automatización y la integración. [18] [205] En algunos estudios, el rendimiento de la extracción de microfluidos basada en gotas se compara estrechamente con el método del matraz agitado. [206] Un estudio que comparó los métodos de extracción en matraz agitado y líquido-líquido microfluídico para 26 compuestos y encontró una estrecha correlación entre los valores obtenidos (R2 = 0,994). [207]
También se ha demostrado que los dispositivos de extracción líquido-líquido de microfluidos se pueden integrar con otros instrumentos para la detección de los analitos extraídos. [208] [48] Por ejemplo, la extracción microfluídica podría usarse para extraer un analito inicialmente en una fase acuosa, como la cocaína en la saliva, y luego interconectarse con espectroscopía IR en chip para su detección. [209] La extracción líquido-líquido con microfluidos ha demostrado ser ventajosa en numerosas aplicaciones, como estudios farmacocinéticos de fármacos donde solo se necesitan números de células pequeños, [210] [48] y en estudios adicionales donde se requieren volúmenes de reactivo más pequeños. [5]
Los sistemas de microfluidos basados en gotas se pueden acoplar a métodos de separación para tareas específicas. Las técnicas de separación comunes acopladas a sistemas de microfluidos basados en gotas incluyen cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y electroforesis .
Muchas formas de cromatografía, incluida la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), la cromatografía líquida de nanoflujo de ultra rendimiento (nano-UPLC o nano-LC) y la cromatografía de flujo capilar bidimensional (LC capilar), se han integrado en el campo de la cromatografía. Microfluidos basados en gotas. [211] [212] [213] A microescala, las técnicas de separación química como HPLC se pueden utilizar en análisis tanto biológicos como químicos. [214] [215] [216] Dentro del campo de la microfluídica, estas técnicas se han aplicado a sistemas de microfluidos en tres etapas diferentes del proceso de microfluidos. Las columnas de HPLC fuera del chip se utilizan para separar analitos antes de introducirlos en un dispositivo de microfluidos para su fraccionamiento y análisis. [214] Las columnas de HPLC también se pueden construir directamente en chips de laboratorio de microfluidos creando dispositivos híbridos monolíticos capaces de realizar separación química, así como formación y manipulación de gotas. [215] [217] Además, la HPLC se utiliza al final de la química de microfluidos basada en gotas como una forma de purificar, analizar y cuantificar los productos de un experimento. [218] [219] [220]
Los dispositivos de microfluidos basados en gotas acoplados a HPLC tienen una alta sensibilidad de detección, utilizan volúmenes bajos de reactivos, tienen tiempos de análisis cortos y una contaminación cruzada mínima de los analitos, lo que los hace eficientes en muchos aspectos. [221] Sin embargo, todavía existen problemas asociados con la cromatografía a microescala, como la dispersión de bandas separadas, la difusión y el "volumen muerto" en los canales después de la separación. [215] Una forma de evitar estos problemas es el uso de gotas para compartimentar las bandas de separación, lo que combate la difusión y la pérdida de analitos separados. [216] En los primeros intentos de integrar la cromatografía con microfluidos de gotas, los caudales y presiones más bajos requeridos para la LC capilar 2-D proporcionaron menos obstáculos que superar al combinar estas tecnologías e hicieron posible acoplar múltiples técnicas de separación 2-D en un dispositivo (es decir, HPLC x LC , LC x LC y HPLC x HPLC). [213] Los muestreadores automáticos de HPLC que se alimentan en dispositivos de microfluidos han aprovechado la dispersión que se produce entre la separación y la formación de gotas para alimentar pulsos de gradiente de analitos en dispositivos de microfluidos donde la producción de miles de gotas de picolitros captura concentraciones de analitos únicas. [222] Enfoques similares han utilizado las capacidades de extracción de una bomba de jeringa para alinear los caudales relativamente altos necesarios para HPLC con los caudales más bajos del medio continuo común en los dispositivos de microfluidos. [214] El desarrollo de nano-LC, o nano-UPLC, ha brindado otra oportunidad para acoplarse con dispositivos de microfluidos de modo que se puedan formar grandes bibliotecas de gotas con múltiples dimensiones de información almacenadas en cada gota. En lugar de identificar picos y almacenarlos como una sola muestra, como se ve en la LC estándar, estas bibliotecas de gotas permiten conservar la concentración específica del analito junto con su identidad. [211] Además, la capacidad de realizar fraccionamiento de alta frecuencia inmediatamente a partir del eluyente de una columna nano-LC ha aumentado considerablemente la resolución máxima y ha mejorado la calidad general de la separación en comparación con los dispositivos nano-LC de flujo continuo. [212]
Primero se construyó una columna de HPLC directamente en un dispositivo de microfluidos utilizando TPE en lugar de PDMS para la fabricación del dispositivo. [215] La resistencia adicional del TPE lo hizo capaz de soportar las presiones más altas necesarias para la HPLC, de modo que un único chip de laboratorio de microfluidos podría realizar la separación química, el fraccionamiento y la manipulación adicional de las gotas. [215] Para aumentar la calidad de la salida cromatográfica, dispositivos más resistentes hechos de vidrio han demostrado la capacidad de soportar una presión mucho mayor que el TPE. Lograr estas presiones más altas para aumentar el grado de separación y eliminar todos los volúmenes muertos mediante la formación inmediata de gotas ha demostrado el potencial de los microfluidos de gotas para expandir y mejorar las capacidades de las separaciones por HPLC. [217]
La electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en gel microcapilar (μCGE) son métodos de electroforesis con microchip (MCE) bien reconocidos que pueden proporcionar numerosas ventajas analíticas, incluida alta resolución, alta sensibilidad y acoplamiento eficaz a la espectrometría de masas (MS). [223] [224] [225] La electroforesis con microchip se puede aplicar generalmente como método para procesos de detección de alto rendimiento que ayudan a descubrir y evaluar fármacos. [224] Utilizando MCE, específicamente CE, se crean dispositivos de electroforesis en gel microcapilar (μCGE) para realizar un procesamiento de muestras de ADN de gran número, lo que los convierte en un buen candidato para el análisis de ADN. [225] [226] Los dispositivos μCGE también son prácticos para fines de separación porque utilizan separación, caracterización, encapsulación y selección en línea de diferentes analitos que se originan a partir de una muestra compuesta. [225] Todas estas ventajas de los métodos MCE se traducen en dispositivos de microfluidos. La razón por la que los métodos MCE se acoplan a dispositivos de microfluidos basados en gotas es por la capacidad de analizar muestras en la escala de nanolitros. [227] El uso de métodos MCE a pequeña escala reduce el costo y el uso de reactivos. [225] De manera similar a la HPLC, las técnicas de detección basadas en fluorescencia se utilizan para la electroforesis capilar, lo que hace que estos métodos sean prácticos y puedan aplicarse a campos como la biotecnología, la química analítica y el desarrollo de fármacos. [228] Estos MCE y otros métodos basados en electroforesis comenzaron a desarrollarse una vez que la electroforesis capilar ganó popularidad en la década de 1980 y ganó aún más atención a principios de la década de 1990, ya que fue revisada casi 80 veces en el año 1992. [229]
La espectrometría de masas (MS) es una técnica de detección casi universal reconocida en todo el mundo como el estándar de oro para la identificación de muchos compuestos. La EM es una técnica analítica en la que las especies químicas se ionizan y clasifican antes de la detección, y el espectro de masas resultante se utiliza para identificar las moléculas originales de los iones. Esto hace que la MS, a diferencia de otras técnicas de detección (como la fluorescencia), no tenga etiquetas; es decir, no hay necesidad de unir ligandos o grupos adicionales a la molécula de interés para recibir una señal e identificar el compuesto.
La espectrometría de masas (MS) es una técnica de detección casi universal reconocida en todo el mundo como el estándar de oro para la identificación de muchos compuestos. La EM es una técnica analítica en la que las especies químicas se ionizan y clasifican antes de la detección, y el espectro de masas resultante se utiliza para identificar las moléculas originales de los iones. Esto hace que la MS, a diferencia de otras técnicas de detección (como la fluorescencia ), no tenga etiquetas; es decir, no hay necesidad de unir ligandos o grupos adicionales a la molécula de interés para recibir una señal e identificar el compuesto.
Hay muchos casos en los que otros métodos espectroscópicos, como la resonancia magnética nuclear ( RMN ), la fluorescencia , el infrarrojo o el Raman , no son viables como métodos independientes debido a la composición química particular de las gotas. A menudo, estas gotitas son sensibles a las etiquetas fluorescentes [ 63] o contienen especies que por lo demás son indeterminadamente similares, donde la EM puede emplearse junto con otros métodos para caracterizar un analito específico de interés. [230] [231] Sin embargo, la EM ha ganado popularidad recientemente (en la última década) como método de detección para microfluidos basados en gotas (y los microfluidos en su conjunto) debido a los desafíos asociados con el acoplamiento de espectrómetros de masas con estos dispositivos miniaturizados. [232] [233] [234] La dificultad de separación/purificación hace que los sistemas a escala completamente microfluídicos acoplados a la espectrometría de masas sean ideales en los campos de la proteómica, [235] [63] [236] [237] cinética enzimática, [238] descubrimiento de fármacos , [239] y detección de enfermedades del recién nacido. [240] Los dos métodos principales de ionización para análisis de masas utilizados en microfluidos basados en gotas en la actualidad son la desorción/ionización láser asistida por matriz ( MALDI ) [241] [242] y la ionización por electropulverización ( ESI ). [63] También se están desarrollando métodos adicionales para el acoplamiento, como (entre otros) la nebulización de ondas acústicas superficiales ( SAWN ), [243] y la ionización por pulverización de papel en MS miniaturizado, [244] . [232] [245]
Una complicación que ofrece el acoplamiento de MS a microfluidos basados en gotas es que las muestras dispersas se producen a caudales comparativamente bajos en comparación con las técnicas tradicionales de inyección de MS. ESI puede aceptar fácilmente estos bajos caudales y ahora se utiliza comúnmente para análisis de microfluidos en línea. [232] [223] [246] [247] ESI y MALDI ofrecen una respuesta de alto rendimiento al problema de la detección de gotas sin etiquetas, pero ESI requiere elementos de preparación y fabricación de muestras menos intensivos que sean escalables a la escala de dispositivos de microfluidos. [235] [247] [246] [248] ESI implica la aplicación de un alto voltaje a una corriente portadora de gotitas que contienen analito, que aerosoliza la corriente, seguido de la detección en una región del analizador de potencial diferenciado. El fluido portador dentro de un dispositivo de microfluidos basado en gotas, típicamente un aceite, es a menudo un obstáculo dentro de ESI. El aceite, cuando forma parte del flujo de gotas que ingresan a un instrumento ESI-MS, puede causar un voltaje de fondo constante que interfiere con la detección de gotas de muestra. [223] Esta interferencia de fondo se puede rectificar cambiando el aceite utilizado como fluido portador y ajustando el voltaje utilizado para el electrospray. [223] [235]
El tamaño de las gotas, la forma del cono de Taylor y el caudal se pueden controlar variando el diferencial de potencial y la temperatura de una corriente de gas (generalmente nitrógeno) que se seca (para evaporar el disolvente circundante al analito). [249] Debido a que ESI permite la detección de gotas en línea, se pueden resolver otros problemas que plantean los sistemas basados en detección segmentada o fuera de chip, como la minimización de la dilución de la muestra (gotas), que es especialmente crítica para la detección de gotas de microfluidos donde las muestras de analitos son ya diluido a la concentración experimental más baja relevante. [250]
MALDI se caracteriza por el uso de un láser ultravioleta ( UV ) para desencadenar la ablación de especies de analitos que se mezclan con una matriz de moléculas cristalizadas con alta absorción óptica. [234] Los iones dentro de los gases de ablación resultantes luego se protonan o desprotonan antes de acelerarlos en un espectrómetro de masas. Las principales ventajas de la detección MALDI sobre ESI en dispositivos de microfluidos son que MALDI permite una multiplexación mucho más sencilla , [251] [252], lo que aumenta aún más el rendimiento general del dispositivo , [242] así como una menor dependencia de las piezas móviles y la ausencia. de los problemas de estabilidad del cono de Taylor planteados por los caudales a escala de microfluidos. [253] [254] La velocidad de detección de MALDI, junto con la escala de las gotas de microfluidos, permite mejoras en las técnicas de macroescala tanto en el rendimiento como en la resolución del tiempo de vuelo ( TOF ). [238] [242] Mientras que las configuraciones típicas de detección de MS a menudo utilizan técnicas de separación como la cromatografía, las configuraciones MALDI requieren que una muestra suficientemente purificada se mezcle con matrices orgánicas predeterminadas, adecuadas para la muestra específica, antes de la detección. [236] La composición de la matriz MALDI debe ajustarse para producir una fragmentación y ablación apropiadas de los analitos.
Un método para obtener una muestra purificada a partir de microfluidos a base de gotitas es terminar el canal de microfluidos en una placa MALDI, formando gotitas acuosas en regiones hidrófilas de la placa. [234] [252] [253] [255] Luego se deja que el disolvente y el fluido portador se evaporen, dejando solo las gotitas secas de la muestra de interés, después de lo cual se aplica la matriz MALDI a las gotitas secas. Esta preparación de muestras tiene notables limitaciones y complicaciones, que actualmente no se superan para todo tipo de muestras. Además, las matrices MALDI se encuentran preferentemente en concentraciones mucho más altas que la muestra de analito, lo que permite incorporar el transporte de gotas de microfluidos a la producción de matrices MALDI en línea. Debido al bajo número de matrices conocidas y a la naturaleza de prueba y error para encontrar nuevas composiciones de matrices apropiadas, [256] este puede ser el factor determinante en el uso de otras formas de espectroscopia en lugar de MALDI. [234] [232] [257]
La espectroscopia Raman es una técnica espectroscópica que proporciona un análisis no destructivo capaz de identificar componentes dentro de mezclas con especificidad química sin una preparación compleja de muestras. [258] La espectroscopia Raman se basa en la dispersión de fotones después de la radiación de luz visible, donde el cambio en las energías de los fotones corresponde a información sobre los modos de vibración del sistema y sus frecuencias. Al obtener las frecuencias modernas vibratorias se pueden realizar y reforzar clasificaciones cualitativas sobre el sistema. [259]
La espectroscopia Raman funciona bien en paralelo con dispositivos de microfluidos para muchas aplicaciones biológicas cualitativas. [260] Para algunas aplicaciones, se prefiere la espectroscopia Raman a otros métodos de detección, como la espectroscopia infrarroja (IR), ya que el agua tiene una fuerte señal de interferencia con IR pero no con Raman. [261] [262] Asimismo, métodos como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), la resonancia magnética nuclear (NMR), la espectrometría de masas (MS) o la cromatografía de gases (GC) tampoco son ideales, ya que estos métodos requieren tamaños de muestra más grandes. . Dado que los microfluidos permiten experimentos con volúmenes pequeños (incluido el análisis de células individuales o de pocas células), Raman es un método líder de detección de microfluidos. Específicamente, la integración Raman con dispositivos de microfluidos tiene fuertes aplicaciones en sistemas donde es necesaria la identificación de lípidos, algo común en la investigación de biocombustibles . [263] [264] Por ejemplo, un ensayo de fluorescencia de lípidos no es lo suficientemente selectivo y, por lo tanto, no puede identificar diferencias moleculares como lo hace Raman a través de vibraciones moleculares. [265] Raman, cuando se combina con dispositivos de microfluidos, también puede monitorear la mezcla de fluidos y la captura de líquidos y también puede detectar fases sólidas y gaseosas dentro de plataformas de microfluidos, una capacidad que es aplicable al estudio de la solubilidad gas-líquido. [266] [267]
La espectroscopia Raman en dispositivos de microfluidos se aplica y detecta utilizando fibra óptica integrada [268] dentro de un chip de microfluidos o colocando el dispositivo en un microscopio Raman . [269] Además, algunos sistemas de microfluidos utilizan coloide metálico [270] o nanopartículas [271] [272] dentro de la solución para aprovechar la espectroscopía Raman mejorada en superficie (SERS). [273] SERS puede mejorar la dispersión Raman hasta en un factor de 10 11 formando complejos de transferencia de carga en las superficies. [274] [275] De ello se deduce que estos dispositivos se fabrican comúnmente con membranas de policarbonato nanoporosas que permiten un fácil recubrimiento de nanopartículas . [276] Sin embargo, si se fabrica con polidimetilsiloxano (PDMS), puede producirse interferencia de la señal con el espectro Raman. PDMS genera una fuerte señal Raman que puede fácilmente dominar e interferir con la señal deseada. [277] Una solución común para esto es fabricar el dispositivo de microfluidos de manera que se pueda utilizar un orificio confocal para el láser Raman. [264] La microscopía Raman confocal típica permite obtener información espectroscópica de pequeños volúmenes focales de menos de 1 micrón cúbico y, por lo tanto, más pequeños que las dimensiones del canal de microfluidos. [269] La señal Raman es inherentemente débil; por lo tanto, para tiempos de detección cortos en volúmenes de muestra pequeños en dispositivos de microfluidos, se utiliza amplificación de señal. La espectroscopia Raman de fotones múltiples, como la espectroscopia Raman estimulada (SRS) o la espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS), ayudan a mejorar las señales de sustancias en dispositivos de microfluidos. [278]
Para microfluidos basados en gotas, la detección Raman proporciona un análisis en línea de múltiples analitos dentro de gotas o en fase continua. La señal Raman es sensible a los cambios de concentración, por lo tanto, la solubilidad y la cinética de mezcla de un sistema de microfluidos basado en gotas se pueden detectar utilizando Raman. [267] [269] Las consideraciones incluyen la diferencia del índice de refracción en la interfaz de la gota y la fase continua, así como entre las conexiones del fluido y del canal. [266] [269] [279]
La espectroscopia de fluorescencia es una de las técnicas de detección de gotas más comunes. [280] Proporciona una respuesta rápida y, para los analitos aplicables, tiene una señal fuerte. [281] El uso de espectroscopía de fluorescencia en microfluidos sigue un formato similar a la mayoría de las otras técnicas analíticas fluorescentes. Se utiliza una fuente de luz para excitar las moléculas del analito en la muestra, después de lo cual el analito emite fluorescencia y la respuesta de fluorescencia es la salida medida. Se pueden usar cámaras para capturar la señal de fluorescencia de las gotas, [282] y a menudo se usan filtros para filtrar la luz de excitación dispersa. En la detección de gotas de microfluidos, la configuración experimental de un instrumento de fluorescencia puede variar mucho. Una configuración común en la detección de gotas fluorescentes es el uso de un microscopio de epifluorescencia . [280] Esto a veces utiliza una geometría confocal, que puede variar según las necesidades experimentales. Por ejemplo, Jeffries et al. informaron éxito en la exploración de una geometría confocal ortogonal, a diferencia de una geometría epi estándar. [280] Sin embargo, se han explorado otras configuraciones para la detección de fluorescencia, ya que los microscopios de epifluorescencia pueden ser costosos y difíciles de mantener. [281] Cole y otros. han propuesto y probado una configuración experimental con fibra óptica para realizar análisis de fluorescencia de gotas de microfluidos.
La detección de gotas por fluorescencia tiene varias ventajas. En primer lugar, puede adaptarse a un rendimiento grande y rápido. [280] El análisis de miles de muestras se puede realizar en un corto período de tiempo, lo que resulta ventajoso para el análisis de una gran cantidad de muestras. [283] Otra ventaja es la precisión del método. En un análisis realizado por Li et al., se descubrió que el uso de técnicas de detección de fluorescencia produjo una precisión de detección del 100 % en 13 de 15 imágenes recopiladas. Los dos restantes tuvieron errores relativos de alrededor del 6%. [282] Otra ventaja de la detección de fluorescencia es que permite el análisis cuantitativo del espaciado de las gotas en una muestra. [284] Esto se hace mediante el uso de mediciones temporales y la velocidad del flujo del analito. [285] El espacio de tiempo entre señales permite calcular el espacio entre gotas. Se pueden utilizar análisis de fluorescencia adicionales de muestras de gotitas de microfluidos para medir la vida útil fluorescente de las muestras, lo que proporciona información adicional que no se puede obtener solo con mediciones de intensidad de fluorescencia. [286]
Las aplicaciones de la detección por fluorescencia son variadas, centrándose muchos de sus usos en aplicaciones biológicas. Frenz et al. utilizaron la detección de fluorescencia de gotas para examinar la cinética de la enzima. Para este experimento, la b-lactamasa interactuó con fluorocilina, un sustrato fluorogénico. La fluorescencia de las gotas se midió en múltiples intervalos de tiempo para examinar el cambio con el tiempo. [27] Sin embargo, este método de detección va más allá de las aplicaciones biológicas y permite el estudio físico de la formación y evolución de las gotas. Por ejemplo, Sakai et al. utilizaron detección de fluorescencia para controlar el tamaño de las gotas. [287] Esto se hizo recopilando datos de fluorescencia para calcular la concentración de un tinte fluorescente dentro de una sola gota, permitiendo así monitorear el crecimiento del tamaño. El uso de técnicas de detección de fluorescencia se puede ampliar a aplicaciones más allá de la recopilación de datos; Un método ampliamente utilizado para la clasificación de células y gotas en microfluidos es la clasificación activada por fluorescencia, donde las gotas se clasifican en diferentes canales o salidas de recolección según su intensidad de fluorescencia. [91]
Se han utilizado puntos cuánticos fluorescentes para desarrollar plataformas de biodetección [288] y administración de fármacos en dispositivos de microfluidos. Los puntos cuánticos son útiles debido a su pequeño tamaño, longitud de onda de excitación precisa y alto rendimiento cuántico . [288] [289] Estas son ventajas sobre los tintes tradicionales que pueden interferir con la actividad del compuesto estudiado. [289] Sin embargo, la creación masiva y la conjugación de puntos cuánticos con moléculas de interés sigue siendo un desafío. [288] [290] Se han diseñado dispositivos de microfluidos que conjugan nucleótidos con puntos cuánticos para resolver este problema reduciendo significativamente el tiempo de conjugación de dos días a minutos. [291] [290] Los conjugados de ADN y puntos cuánticos son importantes para detectar ADN y miARN complementarios en sistemas biológicos. [292]
La detección electroquímica sirve como una alternativa económica no solo para medir la composición química en ciertos casos, sino también la longitud, frecuencia, conductividad y velocidad de las gotas a altas velocidades y generalmente con muy poca compensación de espacio en el chip. [66] [283] El método se analizó por primera vez en Luo et al. donde el equipo pudo medir con éxito el tamaño y la concentración de iones en gotitas de picolitros que contienen iones de NaCl disueltos. [293] Por lo general, se realiza con un conjunto o serie de microelectrodos que miden las perturbaciones de la corriente; las gotas más pequeñas dan perturbaciones más pequeñas mientras que las gotas más grandes dan curvas más largas. El número de perturbaciones en la corriente también puede indicar la frecuencia de las gotas que pasan por el electrodo como una forma de determinar también la velocidad de las gotas. [294] Se han sugerido varios compuestos diferentes para su uso dentro de los electrodos, ya que las lecturas exactas, precisas y significativas pueden ser difíciles dentro de la microescala. Estos compuestos van desde electrodos de pasta de carbón que se aplican directamente al chip hasta negro de platino electrodepositado sobre alambre de platino junto con un cloruro de plata sobre un microelectrodo de plata para aumentar la actividad y el área de superficie. [295]
En cuanto a la composición química, las lecturas se logran mediante análisis cronoamperométrico de compuestos electroactivos dentro de las gotas como se indicó anteriormente. El potencial varía dependiendo de los iones eléctricamente viables, los iones de sodio y cloro disueltos en este experimento y sus concentraciones dentro de cada gota. [283] [294] Otro grupo mostró, con una serie de controles, que la composición de gotas mixtas que involucraban yoduro de potasio se detectó con precisión en la escala de tiempo de segundos con rangos óptimos de voltaje, velocidad y pH. [296] Además de esto, se está desarrollando un enfoque más exclusivo dentro de las lecturas cronoamperométricas, donde se han creado sistemas magnetofluídicos y las lecturas de potencial se miden en fluidos que de otro modo serían electroinactivos mediante la disolución de micropartículas magnéticas en el reactivo. [297] Este método se ha mejorado en un entorno de microfluidos digitales (DMF), donde electrodos de oro y plata en unión con micropartículas magnéticas disueltas en los fluidos reemplazaron la típica detección de gotas basada en fluorescencia en el inmunoensayo de analitos de biomarcadores. [298]
El experimento anterior de Shamsi et al, alude al uso principal para la detección electroquímica en microfluidos; biodetección para diversas mediciones, como la cinética enzimática y ensayos biológicos de muchos otros tipos de células. [299] [300] Se necesita un mayor control del sistema para estos procesos, ya que al aumentar el caudal, la detección de enzimas disminuye. Aunque a medida que avanza una reacción enzimática, la lectura amperométrica también evolucionará, lo que permitirá un seguimiento rápido de la cinética. [301] Además, los tensioactivos específicos pueden carecer de biocompatibilidad con el sistema, lo que afecta la enzima y distorsiona la detección. [302] Los alcances de esta aplicación incluso han tenido efectos en la acuicultura y la economía, ya que la detección electroquímica se ha utilizado para probar rápidamente la frescura del pescado. [301] El uso de este método de detección se encuentra principalmente en la electrohumectación de DMF dieléctricos, donde el aparato del electrodo sensor puede ser reconfigurable y tiene una vida útil más larga sin dejar de producir resultados precisos. [303]
{{cite book}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace )