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Evolución dirigida

Un ejemplo de evolución dirigida en comparación con la evolución natural . El ciclo interno indica las 3 etapas del ciclo de evolución dirigida y el proceso natural se imita entre paréntesis. El círculo exterior muestra los pasos de un experimento típico. Los símbolos rojos indican variantes funcionales, los símbolos pálidos indican variantes con función reducida.

La evolución dirigida ( DE ) es un método utilizado en ingeniería de proteínas que imita el proceso de selección natural para dirigir proteínas o ácidos nucleicos hacia un objetivo definido por el usuario. [1] Consiste en someter un gen a rondas iterativas de mutagénesis (crear una biblioteca de variantes), selección (expresar esas variantes y aislar miembros con la función deseada) y amplificación (generar una plantilla para la siguiente ronda). Puede realizarse in vivo (en organismos vivos) o in vitro (en células o libre en solución). La evolución dirigida se utiliza tanto para la ingeniería de proteínas como una alternativa al diseño racional de proteínas modificadas, como para estudios de evolución experimental de principios evolutivos fundamentales en un entorno de laboratorio controlado.

Historia

La evolución dirigida tiene su origen en los años 1960 [2] con la evolución de las moléculas de ARN en el experimento del " Monstruo de Spiegelman ". [3] El concepto se extendió a la evolución de proteínas a través de la evolución de bacterias bajo presiones de selección que favorecieron la evolución de un solo gen en su genoma. [4]

Las primeras técnicas de presentación de fagos en la década de 1980 permitieron dirigir las mutaciones y seleccionar una sola proteína. [5] Esto permitió la selección de proteínas de unión mejoradas , pero aún no era compatible con la selección de la actividad catalítica de las enzimas . [6] Los métodos para desarrollar enzimas se desarrollaron en la década de 1990 y llevaron la técnica a una audiencia científica más amplia. [7] El campo se expandió rápidamente con nuevos métodos para crear bibliotecas de variantes genéticas y detectar su actividad. [2] [8] El desarrollo de métodos de evolución dirigida fue honrado en 2018 con la concesión del Premio Nobel de Química a Frances Arnold por la evolución de enzimas, y a George Smith y Gregory Winter por la exhibición de fagos. [9]

Principios

La evolución dirigida es análoga a escalar una colina en un " paisaje apto " donde la elevación representa la propiedad deseada. Cada ronda de selección toma muestras de mutantes en todos los lados de la plantilla inicial (1) y selecciona el mutante con la elevación más alta, subiendo así la colina. Esto se repite hasta alcanzar una cumbre local (2).

La evolución dirigida es una imitación del ciclo de evolución natural en un entorno de laboratorio. La evolución requiere que sucedan tres cosas: variación entre replicadores, que la variación cause diferencias de aptitud sobre las cuales actúa la selección, y que esta variación sea hereditaria . En la DE, un solo gen evoluciona mediante rondas iterativas de mutagénesis, selección o detección y amplificación. [10] Las rondas de estos pasos generalmente se repiten, utilizando la mejor variante de una ronda como modelo para la siguiente para lograr mejoras graduales.

La probabilidad de éxito en un experimento de evolución dirigida está directamente relacionada con el tamaño total de la biblioteca, ya que evaluar más mutantes aumenta las posibilidades de encontrar uno con las propiedades deseadas. [11]

Generando variación

Gen inicial (izquierda) y biblioteca de variantes (derecha). Las mutaciones puntuales cambian nucleótidos individuales. Las inserciones y eliminaciones agregan o eliminan secciones de ADN. La mezcla aleatoria recombina segmentos de dos (o más) genes similares.
Cómo se generan bibliotecas de ADN mediante mutagénesis aleatoria en el espacio de secuencia de muestras. Se muestra el aminoácido sustituido en una posición determinada. Cada punto o conjunto de puntos conectados es un miembro de la biblioteca. La PCR propensa a errores muta aleatoriamente algunos residuos en otros aminoácidos. El escaneo de alanina reemplaza cada residuo de la proteína con alanina, uno por uno. La saturación del sitio sustituye cada uno de los 20 posibles aminoácidos (o algún subconjunto de ellos) en una única posición, uno por uno.

El primer paso para realizar un ciclo de evolución dirigida es la generación de una biblioteca de genes variantes. El espacio de secuencia para secuencias aleatorias es vasto (10 130 secuencias posibles para una proteína de 100 aminoácidos ) y está extremadamente escasamente poblado por proteínas funcionales. Ni la evolución experimental, [12] ni la natural [13] [ verificación fallida ] podrán acercarse jamás a muestrear tantas secuencias. Por supuesto, la evolución natural toma muestras de secuencias variantes cercanas a secuencias de proteínas funcionales y esto se imita en la DE mediante la mutagenización de un gen ya funcional. Algunos cálculos sugieren que es totalmente factible que, para todos los fines prácticos (es decir, funcionales y estructurales), el espacio de secuencias de proteínas haya sido explorado plenamente durante el curso de la evolución de la vida en la Tierra. [13]

El gen de partida puede mutarse mediante mutaciones puntuales aleatorias (mediante mutágenos químicos o PCR propensa a errores ) [14] [15] e inserciones y eliminaciones (mediante transposones). [16] La recombinación de genes se puede imitar mezclando el ADN [17] [18] de varias secuencias (normalmente con más del 70 % de identidad de secuencia) para saltar a regiones del espacio de secuencia entre los genes originales mezclados. Por último, regiones específicas de un gen pueden aleatorizarse sistemáticamente [19] para lograr un enfoque más centrado basado en el conocimiento de la estructura y la función. Dependiendo del método, la biblioteca generada variará en la proporción de variantes funcionales que contiene. Incluso si se utiliza un organismo para expresar el gen de interés, al mutagenizar sólo ese gen, el resto del genoma del organismo permanece igual y puede ignorarse para el experimento de evolución (hasta el punto de proporcionar un entorno genético constante).

Detectar diferencias de aptitud

La mayoría de las mutaciones son perjudiciales, por lo que las bibliotecas de mutantes tienden a tener en su mayoría variantes con actividad reducida . [20] Por lo tanto, un ensayo de alto rendimiento es vital para medir la actividad y encontrar variantes raras con mutaciones beneficiosas que mejoren las propiedades deseadas. Existen dos categorías principales de métodos para aislar variantes funcionales. Los sistemas de selección acoplan directamente la función de la proteína con la supervivencia del gen, mientras que los sistemas de selección analizan individualmente cada variante y permiten establecer un umbral cuantitativo para clasificar una variante o población de variantes de una actividad deseada. Tanto la selección como el cribado se pueden realizar en células vivas ( evolución in vivo ) o directamente en la proteína o ARN sin células ( evolución in vitro ). [21] [22]

Durante la evolución in vivo , cada célula (normalmente bacterias o levaduras ) se transforma con un plásmido que contiene un miembro diferente de la biblioteca de variantes. De esta manera, sólo el gen de interés difiere entre las células, mientras que todos los demás genes se mantienen iguales. Las células expresan la proteína en su citoplasma o en la superficie donde se puede probar su función. Este formato tiene la ventaja de seleccionar propiedades en un entorno celular, lo que resulta útil cuando la proteína o el ARN evolucionado se va a utilizar en organismos vivos. Cuando se realiza sin células, la DE implica el uso de traducción de la transcripción in vitro para producir proteínas o ARN libres en solución o compartimentados en microgotas artificiales . Este método tiene la ventaja de ser más versátil en las condiciones de selección (por ejemplo, temperatura, disolvente) y puede expresar proteínas que serían tóxicas para las células. Además, los experimentos de evolución in vitro pueden generar bibliotecas mucho más grandes (hasta 10 15 ) porque no es necesario insertar el ADN de la biblioteca en las células (a menudo un paso limitante).

Selección

La selección para la actividad vinculante es conceptualmente simple. La molécula objetivo se inmoviliza sobre un soporte sólido, se hace fluir sobre ella una biblioteca de proteínas variantes, se eliminan los aglutinantes deficientes y se recuperan las variantes unidas restantes para aislar sus genes. [23] La unión de una enzima a un inhibidor covalente inmovilizado también se ha utilizado como un intento de aislar catalizadores activos. Sin embargo, este enfoque sólo selecciona el recambio catalítico único y no es un buen modelo de unión de sustrato o de reactividad verdadera del sustrato. Si una actividad enzimática puede hacerse necesaria para la supervivencia celular, ya sea sintetizando un metabolito vital o destruyendo una toxina, entonces la supervivencia celular es una función de la actividad enzimática. [24] [25] Estos sistemas generalmente solo están limitados en rendimiento por la eficiencia de transformación de las células. También son menos costosos y requieren menos mano de obra que los exámenes de detección; sin embargo, suelen ser difíciles de diseñar, propensos a generar artefactos y no brindan información sobre la variedad de actividades presentes en la biblioteca.

Poner en pantalla

Una alternativa a la selección es un sistema de selección. Cada gen variante se expresa y analiza individualmente para medir cuantitativamente la actividad (la mayoría de las veces mediante un producto colorógeno o fluorogénico ). Luego se clasifican las variantes y el experimentador decide qué variantes utilizar como plantillas para la siguiente ronda de DE. Incluso los ensayos de mayor rendimiento suelen tener una cobertura menor que los métodos de selección, pero ofrecen la ventaja de producir información detallada sobre cada una de las variantes analizadas. Estos datos desglosados ​​también pueden utilizarse para caracterizar la distribución de actividades en las bibliotecas, lo que no es posible con sistemas de selección simples. Por lo tanto, los sistemas de detección tienen ventajas cuando se trata de caracterizar experimentalmente paisajes de evolución adaptativa y aptitud física.

Asegurar la herencia

Una proteína expresada puede estar unida covalentemente a su gen (como en el ARNm , izquierda) o compartimentarse con él ( células o compartimentos artificiales , derecha). Cualquiera de las dos formas garantiza que el gen pueda aislarse en función de la actividad de la proteína codificada.

Cuando se han aislado proteínas funcionales, es necesario que sus genes también lo estén, por lo que se requiere un vínculo genotipo-fenotipo . [24] Esto puede ser covalente, como la presentación de ARNm donde el gen de ARNm está vinculado a la proteína al final de la traducción por puromicina. [12] Alternativamente, la proteína y su gen se pueden co-localizar mediante compartimentación en células vivas [26] o gotitas de emulsión. [27] Las secuencias de genes aisladas se amplifican luego mediante PCR o mediante bacterias huésped transformadas. Se puede utilizar la mejor secuencia individual o un conjunto de secuencias como plantilla para la siguiente ronda de mutagénesis. Los ciclos repetidos de Diversificación-Selección-Amplificación generan variantes de proteínas adaptadas a las presiones de selección aplicadas.

Comparación con el diseño racional de proteínas.

Ventajas de la evolución dirigida

El diseño racional de una proteína se basa en un conocimiento profundo de la estructura de la proteína , así como de su mecanismo catalítico . [28] [29] Luego se realizan cambios específicos mediante mutagénesis dirigida al sitio en un intento de cambiar la función de la proteína. Un inconveniente de esto es que incluso cuando la estructura y el mecanismo de acción de la proteína son bien conocidos, el cambio debido a la mutación sigue siendo difícil de predecir. Por lo tanto, una ventaja de la DE es que no es necesario comprender el mecanismo de la actividad deseada o cómo la afectarían las mutaciones. [30]

Limitaciones de la evolución dirigida.

Una restricción de la evolución dirigida es que se requiere un ensayo de alto rendimiento para medir los efectos de una gran cantidad de mutaciones aleatorias diferentes. Esto puede requerir una investigación y un desarrollo exhaustivos antes de que pueda utilizarse para la evolución dirigida. Además, estos ensayos suelen ser muy específicos para monitorear una actividad particular y, por lo tanto, no son transferibles a nuevos experimentos de DE. [31]

Además, seleccionar una mejora en la función ensayada simplemente genera mejoras en la función ensayada. Para comprender cómo se logran estas mejoras, es necesario medir las propiedades de la enzima en evolución. La mejora de la actividad analizada puede deberse a mejoras en la actividad catalítica enzimática o en la concentración de enzima. Tampoco hay garantía de que la mejora en un sustrato mejore la actividad en otro. Esto es particularmente importante cuando la actividad deseada no se puede examinar o seleccionar directamente y, por lo tanto, se utiliza un sustrato "proxy". La DE puede conducir a una especialización evolutiva del proxy sin mejorar la actividad deseada. En consecuencia, elegir las condiciones adecuadas de detección o selección es vital para una DE exitosa. [32]

La velocidad de la evolución en un experimento también plantea una limitación a la utilidad de la evolución dirigida. Por ejemplo, la evolución de un fenotipo particular, si bien es teóricamente factible, puede ocurrir en escalas de tiempo que no son factibles en la práctica. [33] Los enfoques teóricos recientes han tenido como objetivo superar la limitación de la velocidad mediante la aplicación de técnicas de conducción contradiabática de la física estadística, aunque esto aún no se ha implementado en un experimento de evolución dirigida. [34]

Enfoques combinatorios

Se están investigando enfoques combinados y "semirracionales" para abordar las limitaciones tanto del diseño racional como de la evolución dirigida. [1] [35] Las mutaciones beneficiosas son raras, por lo que es necesario examinar un gran número de mutantes aleatorios para encontrar variantes mejoradas. Las 'bibliotecas enfocadas' se concentran en aleatorizar regiones que se cree que son más ricas en mutaciones beneficiosas para el paso de mutagénesis de la DE. Una biblioteca enfocada contiene menos variantes que una biblioteca de mutagénesis aleatoria tradicional y, por lo tanto, no requiere una detección de alto rendimiento.

La creación de una biblioteca enfocada requiere cierto conocimiento de qué residuos de la estructura mutar. Por ejemplo, el conocimiento del sitio activo de una enzima puede permitir aleatorizar sólo los residuos que se sabe que interactúan con el sustrato . [36] [37] Alternativamente, el conocimiento de qué regiones proteicas son de naturaleza variable puede guiar la mutagénesis solo en esas regiones. [38] [39]

Aplicaciones

La evolución dirigida se utiliza con frecuencia para la ingeniería de proteínas como una alternativa al diseño racional , [40] pero también se puede utilizar para investigar cuestiones fundamentales de la evolución de enzimas. [41]

Ingeniería de proteínas

Como herramienta de ingeniería de proteínas, la DE ha tenido más éxito en tres áreas:

  1. Mejora de la estabilidad de las proteínas para uso biotecnológico a altas temperaturas o en disolventes fuertes [42] [43] [44]
  2. Mejora de la afinidad de unión de los anticuerpos terapéuticos ( maduración de afinidad ) [45] y la actividad de las enzimas diseñadas de novo [30]
  3. Alteración de la especificidad del sustrato de enzimas existentes, [46] [47] [48] [49] (a menudo para uso en la industria) [40]

Estudios de evolución

El estudio de la evolución natural se basa tradicionalmente en los organismos existentes y sus genes. Sin embargo, la investigación está fundamentalmente limitada por la falta de fósiles (y particularmente la falta de secuencias de ADN antiguas ) [50] [51] y el conocimiento incompleto de las condiciones ambientales antiguas. La evolución dirigida investiga la evolución en un sistema controlado de genes para enzimas individuales , [52] [53] [35] ribozimas [54] y replicadores [55] [3] (similar a la evolución experimental de eucariotas , [56] [57] procariotas [58] y virus [59] ).

DE permite controlar la presión de selección , la tasa de mutación y el entorno (tanto el entorno abiótico como la temperatura, como el entorno biótico, como otros genes del organismo). Además, existe un registro completo de todos los genes intermedios evolutivos. Esto permite mediciones detalladas de los procesos evolutivos, por ejemplo, epistasis , capacidad de evolución , restricción adaptativa [60] [61] paisajes de aptitud , [62] y redes neutrales . [63]

Evolución adaptativa de laboratorio de proteomas microbianos.

La composición natural de aminoácidos de los proteomas puede cambiarse mediante sustituciones globales de aminoácidos canónicos con homólogos no canónicos adecuados bajo la presión selectiva impuesta experimentalmente . Por ejemplo, se han intentado sustituciones globales de aminoácidos naturales en todo el proteoma con análogos fluorados en Escherichia coli [64] y Bacillus subtilis . [65] Budisa y Söll informaron en 2015 de una sustitución completa de triptófano con tienopirrol-alanina en respuesta a 20899 codones UGG en Escherichia coli . [66] Se espera que la evolución experimental de cepas microbianas con una acomodación clara de un aminoácido adicional sea fundamental para ampliar el código genético de forma experimental. [67] La ​​evolución dirigida típicamente apunta a un gen particular para la mutagénesis y luego selecciona las variantes resultantes para un fenotipo de interés, a menudo independiente de los efectos de aptitud , mientras que la evolución adaptativa de laboratorio selecciona muchas mutaciones en todo el genoma que contribuyen a la aptitud de culturas en crecimiento activo. [68]

Ver también

Referencias

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