La electroforesis capilar ( CE ) es una familia de métodos de separación electrocinética realizados en capilares de diámetro submilimétrico y en canales de micro y nanofluidos. Muy a menudo, CE se refiere a electroforesis de zona capilar ( CZE ), pero otras técnicas electroforéticas , incluida la electroforesis en gel capilar (CGE), el enfoque isoeléctrico capilar (CIEF), la isotacoforesis capilar y la cromatografía electrocinética micelar (MEKC), también pertenecen a esta clase de métodos. [1] En los métodos CE, los analitos migran a través de soluciones electrolíticas bajo la influencia de un campo eléctrico . Los analitos se pueden separar según la movilidad iónica y/o dividirse en una fase alternativa mediante interacciones no covalentes . Además, los analitos pueden concentrarse o "focalizarse" mediante gradientes de conductividad y pH .
La instrumentación necesaria para realizar la electroforesis capilar es relativamente sencilla. En la figura 1 se muestra un esquema básico de un sistema de electroforesis capilar . Los componentes principales del sistema son un vial de muestra, viales de origen y destino, un capilar, electrodos , una fuente de alimentación de alto voltaje , un detector y un dispositivo de manipulación y salida de datos. El vial de origen, el vial de destino y el capilar se llenan con un electrolito, como una solución tampón acuosa. Para introducir la muestra, la entrada capilar se coloca en un vial que contiene la muestra. La muestra se introduce en el capilar mediante acción capilar , presión, sifón o electrocinéticamente, y luego el capilar se devuelve al vial de origen. La migración de los analitos se inicia mediante un campo eléctrico que se aplica entre los viales de origen y de destino y se suministra a los electrodos mediante la fuente de alimentación de alto voltaje. En el modo más común de CE, todos los iones, positivos o negativos, son arrastrados a través del capilar en la misma dirección mediante un flujo electroosmótico . Los analitos se separan a medida que migran debido a su movilidad electroforética y se detectan cerca del extremo de salida del capilar. La salida del detector se envía a un dispositivo de manejo y salida de datos, como un integrador o una computadora . Luego, los datos se muestran como un electroferograma, que informa la respuesta del detector en función del tiempo . Los compuestos químicos separados aparecen como picos con diferentes tiempos de migración en un electroferograma. [2] La técnica a menudo se atribuye a James W. Jorgensen y Krynn DeArman Lukacs, quienes demostraron por primera vez las capacidades de esta técnica. [3] Richard D. Smith y sus compañeros de trabajo combinaron por primera vez la electroforesis capilar con la espectrometría de masas y proporciona una sensibilidad extremadamente alta para el análisis de tamaños de muestras muy pequeños. A pesar de los tamaños de muestra muy pequeños (normalmente sólo se introducen unos pocos nanolitros de líquido en el capilar), se logran una alta sensibilidad y picos agudos en parte debido a estrategias de inyección que dan como resultado una concentración de analitos en una zona estrecha cerca de la entrada del capilar. capilar. Esto se logra en inyecciones a presión o electrocinéticas simplemente suspendiendo la muestra en un tampón de menor conductividad ( por ejemplo, menor concentración de sal) que el tampón en funcionamiento. Un proceso llamado apilamiento de muestras amplificadas en campo (una forma de isotacoforesis ) da como resultado la concentración del analito en una zona estrecha en el límite entre la muestra de baja conductividad y el tampón de ejecución de mayor conductividad.
Para lograr un mayor rendimiento de muestras, se utilizan instrumentos con conjuntos de capilares para analizar muchas muestras simultáneamente. Estos instrumentos de electroforesis de matriz capilar (CAE) con 16 o 96 capilares se utilizan para la secuenciación de ADN capilar de rendimiento medio a alto, y los extremos de entrada de los capilares se disponen espacialmente para aceptar muestras directamente de placas de 96 pocillos con huella estándar SBS. Ciertos aspectos de la instrumentación (como la detección) son necesariamente más complejos que los de un sistema de un solo capilar, pero los principios fundamentales de diseño y operación son similares a los que se muestran en la Figura 1.
La separación por electroforesis capilar puede detectarse mediante varios dispositivos de detección. La mayoría de los sistemas comerciales utilizan la absorbancia UV o UV-Vis como principal modo de detección. En estos sistemas, una sección del propio capilar se utiliza como celda de detección. El uso de la detección en tubo permite la detección de analitos separados sin pérdida de resolución. En general, los capilares utilizados en la electroforesis capilar están recubiertos con un polímero (frecuentemente poliimida o teflón ) para aumentar la flexibilidad. Sin embargo, la parte del capilar utilizada para la detección UV debe ser ópticamente transparente. Para los capilares recubiertos de poliimida, normalmente se quema o raspa un segmento del recubrimiento para obtener una ventana desnuda de varios milímetros de largo. Esta sección desnuda de capilar puede romperse fácilmente y hay capilares con recubrimientos transparentes disponibles para aumentar la estabilidad de la ventana celular. La longitud del camino de la celda de detección en electroforesis capilar (~ 50 micrómetros ) es mucho menor que la de una celda UV tradicional (~ 1 cm ). Según la ley de Beer-Lambert , la sensibilidad del detector es proporcional a la longitud del camino de la celda. Para mejorar la sensibilidad, se puede aumentar la longitud del camino, aunque esto resulta en una pérdida de resolución. El tubo capilar en sí se puede expandir en el punto de detección, creando una "celda de burbuja" con un recorrido más largo o se pueden agregar tubos adicionales en el punto de detección, como se muestra en la figura 2 . Sin embargo, ambos métodos disminuirán la resolución de la separación. [4] Esta disminución es casi imperceptible si se produce un aneurisma liso en la pared de un capilar mediante calentamiento y presurización, ya que se puede preservar el flujo pistón. Esta invención de Gary Gordon , patente estadounidense 5061361, normalmente triplica la longitud del camino de absorbancia. Cuando se utiliza con un detector de absorbancia UV, la sección transversal más amplia del analito en la celda permite un haz de iluminación dos veces más grande, lo que reduce el ruido del disparo en un factor de dos. Juntos, estos dos factores aumentan la sensibilidad del detector CE de celda de burbuja de Agilent Technologies seis veces más que la de uno que utiliza un capilar recto. Esta celda y su fabricación se describen en la página 62 de la edición de junio de 1995 del Hewlett-Packard Journal .
La detección de fluorescencia también se puede utilizar en electroforesis capilar para muestras que tienen fluorescencia natural o que están modificadas químicamente para contener etiquetas fluorescentes . Este modo de detección ofrece alta sensibilidad y selectividad mejorada para estas muestras, pero no puede utilizarse para muestras que no son fluorescentes. Se utilizan numerosas estrategias de etiquetado para crear derivados fluorescentes o conjugados de moléculas no fluorescentes, incluidas proteínas y ADN. La configuración para la detección de fluorescencia en un sistema de electroforesis capilar puede resultar complicada. El método requiere que el haz de luz se enfoque en el capilar, lo que puede resultar difícil para muchas fuentes de luz. [4] La fluorescencia inducida por láser se ha utilizado en sistemas CE con límites de detección tan bajos como 10 −18 a 10 −21 mol. La sensibilidad de la técnica se atribuye a la alta intensidad de la luz incidente y a la capacidad de enfocar con precisión la luz en el capilar. [2] La detección de fluorescencia multicolor se puede lograr incluyendo múltiples espejos dicroicos y filtros de paso de banda para separar la emisión de fluorescencia entre múltiples detectores ( por ejemplo, tubos fotomultiplicadores ), o usando un prisma o rejilla para proyectar la emisión de fluorescencia resuelta espectralmente en una posición. -Detector sensible como una matriz CCD . Los sistemas CE con sistemas de detección LIF de 4 y 5 colores se utilizan habitualmente para aplicaciones de secuenciación capilar de ADN y genotipado (" huellas dactilares de ADN "). [5] [6]
Para obtener la identidad de los componentes de la muestra, la electroforesis capilar se puede acoplar directamente con espectrómetros de masas o espectroscopia Raman de superficie mejorada (SERS). En la mayoría de los sistemas, la salida del capilar se introduce en una fuente de iones que utiliza ionización por electropulverización (ESI). Luego, los iones resultantes se analizan mediante el espectrómetro de masas. Esta configuración requiere soluciones tampón volátiles , lo que afectará la gama de modos de separación que se pueden emplear y el grado de resolución que se puede lograr. [4] La medición y el análisis se realizan principalmente con un especialista.
Para CE-SERS, los eluyentes de electroforesis capilar se pueden depositar sobre un sustrato activo en SERS. Los tiempos de retención de analitos se pueden traducir en distancia espacial moviendo el sustrato activo de SERS a una velocidad constante durante la electroforesis capilar. Esto permite aplicar la técnica espectroscópica posterior a eluyentes específicos para su identificación con alta sensibilidad. Se pueden elegir sustratos activos en SERS que no interfieran con el espectro de los analitos. [7]
La separación de compuestos mediante electroforesis capilar depende de la migración diferencial de analitos en un campo eléctrico aplicado. La velocidad de migración electroforética ( ) de un analito hacia el electrodo de carga opuesta es:
La movilidad electroforética se puede determinar experimentalmente a partir del tiempo de migración y de la intensidad del campo:
donde es la distancia desde la entrada hasta el punto de detección, es el tiempo necesario para que el analito alcance el punto de detección (tiempo de migración), es el voltaje aplicado (intensidad de campo) y es la longitud total del capilar. [4] Dado que el campo eléctrico sólo afecta a los iones cargados, los analitos neutros no se separan bien mediante electroforesis capilar.
La velocidad de migración de un analito en la electroforesis capilar también dependerá de la velocidad del flujo electroosmótico (EOF) de la solución tampón. En un sistema típico, el flujo electroosmótico se dirige hacia el cátodo cargado negativamente de modo que el tampón fluya a través del capilar desde el vial de origen al vial de destino. Separados por diferentes movilidades electroforéticas, los analitos migran hacia el electrodo de carga opuesta. [2] Como resultado, los analitos cargados negativamente son atraídos hacia el ánodo cargado positivamente , en contra del EOF, mientras que los analitos cargados positivamente son atraídos hacia el cátodo , de acuerdo con el EOF, como se muestra en la figura 3 .
La velocidad del flujo electroosmótico se puede escribir como:
donde está la movilidad electroosmótica, que se define como:
donde es el potencial zeta de la pared capilar y es la permitividad relativa de la solución tampón. Experimentalmente, la movilidad electroosmótica se puede determinar midiendo el tiempo de retención de un analito neutro. [4] La velocidad ( ) de un analito en un campo eléctrico se puede definir como:
Dado que el flujo electroosmótico de la solución tampón es generalmente mayor que el de la movilidad electroforética de los analitos, todos los analitos son transportados junto con la solución tampón hacia el cátodo. Incluso los aniones pequeños con triple carga pueden ser redirigidos al cátodo mediante el EOF relativamente potente de la solución tampón. Los analitos cargados negativamente se retienen por más tiempo en el capilar debido a sus movilidades electroforéticas conflictivas. [2] El orden de migración visto por el detector se muestra en la figura 3 : los cationes pequeños con carga múltiple migran rápidamente y los aniones pequeños con carga múltiple se retienen con fuerza. [4]
El flujo electroosmótico se observa cuando se aplica un campo eléctrico a una solución en un capilar que tiene cargas fijas en su pared interior. La carga se acumula en la superficie interna de un capilar cuando se coloca una solución tampón dentro del capilar. En un capilar de sílice fundida, los grupos silanol (Si-OH) unidos a la pared interior del capilar se ionizan a grupos silanoato (Si-O − ) cargados negativamente a valores de pH superiores a tres. La ionización de la pared capilar se puede mejorar haciendo pasar primero una solución básica, como NaOH o KOH, a través del capilar antes de introducir la solución tampón. Atraídos por los grupos silanoato cargados negativamente, los cationes cargados positivamente de la solución tampón formarán dos capas internas de cationes (llamadas doble capa difusa o doble capa eléctrica) en la pared capilar como se muestra en la figura 4 . La primera capa se denomina capa fija porque está unida firmemente a los grupos silanoato. La capa exterior, llamada capa móvil, está más alejada de los grupos silanoato. La capa catiónica móvil es arrastrada en dirección al cátodo cargado negativamente cuando se aplica un campo eléctrico. Dado que estos cationes están solvatados , la solución tampón en masa migra con la capa móvil, provocando el flujo electroosmótico de la solución tampón. Otros capilares, incluidos los de teflón , también presentan flujo electroosmótico. El EOF de estos capilares es probablemente el resultado de la adsorción de los iones cargados eléctricamente del tampón en las paredes de los capilares. [2] La tasa de EOF depende de la intensidad del campo y la densidad de carga de la pared capilar. La densidad de carga de la pared es proporcional al pH de la solución tampón. El flujo electroosmótico aumentará con el pH hasta que todos los silanoles disponibles que recubren la pared del capilar estén completamente ionizados. [4]
En determinadas situaciones en las que no es deseable un fuerte flujo electroosmótico hacia el cátodo, la superficie interna del capilar se puede recubrir con polímeros, tensioactivos o moléculas pequeñas para reducir la electroósmosis a niveles muy bajos, restaurando la dirección normal de migración (aniones hacia el ánodo, cationes hacia el cátodo). La instrumentación CE normalmente incluye fuentes de alimentación con polaridad reversible, lo que permite utilizar el mismo instrumento en modo "normal" (con EOF y detección cerca del extremo catódico del capilar) y modo "inverso" (con EOF suprimido o invertido, y detección cerca del extremo catódico del capilar). el extremo anódico del capilar). Uno de los enfoques más comunes para suprimir el EOF, informado por Stellan Hjertén en 1985, es crear una capa unida covalentemente de poliacrilamida lineal . [8] La superficie de sílice del capilar se modifica primero con un reactivo de silano que lleva un grupo vinilo polimerizable ( por ejemplo, 3-metacriloxipropiltrimetoxisilano), seguido de la introducción de monómero de acrilamida y un iniciador de radicales libres . La acrilamida se polimeriza in situ , formando largas cadenas lineales, algunas de las cuales están unidas covalentemente al reactivo de silano unido a la pared. Existen muchas otras estrategias para la modificación covalente de superficies capilares. También son comunes los recubrimientos dinámicos o adsorbidos (que pueden incluir polímeros o moléculas pequeñas). [9] Por ejemplo, en la secuenciación capilar de ADN, el polímero tamizador (típicamente polidimetilacrilamida) suprime el flujo electroosmótico a niveles muy bajos. [10] Además de modular el flujo electroosmótico, los recubrimientos de la pared capilar también pueden servir para reducir las interacciones entre analitos "pegajosos" (como proteínas) y la pared capilar. Estas interacciones pared-analito, si son graves, se manifiestan como una eficiencia máxima reducida, picos asimétricos (colas) o incluso pérdida completa del analito en la pared capilar.
El número de placas teóricas, o eficiencia de separación, en electroforesis capilar viene dado por:
donde es el número de platos teóricos , es la movilidad aparente en el medio de separación y es el coeficiente de difusión del analito. Según esta ecuación, la eficacia de la separación sólo está limitada por la difusión y es proporcional a la intensidad del campo eléctrico, aunque consideraciones prácticas limitan la intensidad del campo eléctrico a varios cientos de voltios por centímetro. La aplicación de potenciales muy altos (>20-30 kV) puede provocar la formación de arcos o la rotura del capilar. Además, la aplicación de campos eléctricos intensos produce un calentamiento resistivo (calentamiento Joule) del tampón en el capilar. Con intensidades de campo suficientemente altas, este calentamiento es lo suficientemente fuerte como para que se puedan desarrollar gradientes radiales de temperatura dentro del capilar. Dado que la movilidad electroforética de los iones generalmente depende de la temperatura (debido tanto a los efectos de la ionización dependiente de la temperatura como a la viscosidad del disolvente), un perfil de temperatura no uniforme da como resultado una variación de la movilidad electroforética a través del capilar y una pérdida de resolución. El inicio de un calentamiento Joule significativo se puede determinar construyendo un "gráfico de la ley de Ohm", en el que la corriente a través del capilar se mide en función del potencial aplicado. En campos bajos, la corriente es proporcional al potencial aplicado ( Ley de Ohm ), mientras que en campos más altos la corriente se desvía de la línea recta a medida que el calentamiento produce una disminución de la resistencia del amortiguador. La mejor resolución normalmente se obtiene con la máxima intensidad de campo para la cual el calentamiento Joule es insignificante ( es decir, cerca del límite entre los regímenes lineal y no lineal del gráfico de la Ley de Ohm). Generalmente, los capilares de diámetro interior más pequeño admiten el uso de intensidades de campo más altas, debido a una mejor disipación de calor y gradientes térmicos más pequeños en relación con los capilares más grandes, pero con los inconvenientes de una menor sensibilidad en la detección de absorbancia debido a una longitud de camino más corta y una mayor dificultad para introducir tampón y muestra en el capilar (los capilares pequeños requieren mayor presión y/o tiempos más largos para forzar los fluidos a través del capilar).
La eficiencia de las separaciones por electroforesis capilar suele ser mucho mayor que la eficiencia de otras técnicas de separación como la HPLC . A diferencia de la HPLC, en la electroforesis capilar no hay transferencia de masa entre fases. [4] Además, el perfil de flujo en los sistemas impulsados por EOF es plano, en lugar del perfil de flujo laminar redondeado característico del flujo impulsado por presión en las columnas de cromatografía, como se muestra en la figura 5 . Como resultado, EOF no contribuye significativamente al ensanchamiento de banda como en la cromatografía impulsada por presión. Las separaciones por electroforesis capilar pueden tener varios cientos de miles de placas teóricas. [11]
La resolución ( ) de las separaciones por electroforesis capilar se puede escribir como:
Según esta ecuación, la resolución máxima se alcanza cuando las movilidades electroforética y electroosmótica son similares en magnitud y de signo opuesto. Además, se puede observar que una alta resolución requiere menor velocidad y, en consecuencia, mayor tiempo de análisis. [4]
Además de la difusión y el calentamiento Joule (discutidos anteriormente), los factores que pueden disminuir la resolución en la electroforesis capilar desde los límites teóricos en la ecuación anterior incluyen, entre otros, los anchos finitos del tapón de inyección y la ventana de detección; interacciones entre el analito y la pared capilar; no idealidades instrumentales tales como una ligera diferencia en la altura de los depósitos de fluido que conducen al sifón; irregularidades en el campo eléctrico debidas, por ejemplo, a extremos de capilares mal cortados; agotamiento de la capacidad de amortiguación de los embalses; y electrodispersión (cuando un analito tiene una conductividad mayor que el electrolito de fondo). [12] Identificar y minimizar las numerosas fuentes de ensanchamiento de bandas es clave para el desarrollo exitoso de métodos en electroforesis capilar, con el objetivo de acercarse lo más posible al ideal de resolución limitada por difusión.
La electroforesis capilar se puede utilizar para la determinación simultánea de los iones NH 4 +, Na + , K + , Mg 2+ y Ca 2+ en la saliva . [13]
Una de las principales aplicaciones de la CE en la ciencia forense es el desarrollo de métodos para la amplificación y detección de fragmentos de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), lo que ha dado lugar a avances rápidos y espectaculares en el análisis de ADN forense. Las separaciones de ADN se llevan a cabo utilizando finos capilares de sílice fundida CE de 50 mm llenos de un tampón de tamizado. Estos capilares tienen excelentes capacidades para disipar el calor, lo que permite utilizar intensidades de campo eléctrico mucho más altas que la electroforesis en gel en placa. Por tanto las separaciones en capilares son rápidas y eficientes. Además, los capilares se pueden rellenar y cambiar fácilmente para realizar inyecciones eficientes y automatizadas. La detección se produce mediante fluorescencia a través de una ventana grabada en el capilar. Tanto los instrumentos de un solo capilar como los de matriz capilar están disponibles con sistemas de matriz capaces de procesar 16 o más muestras simultáneamente para un mayor rendimiento. [14]
Un uso importante de la CE por parte de los biólogos forenses es la tipificación de STR a partir de muestras biológicas para generar un perfil a partir de marcadores genéticos altamente polimórficos que difieren entre individuos. Otros usos emergentes de la CE incluyen la detección de fragmentos de ARNm específicos para ayudar a identificar el origen del fluido biológico o del tejido de una muestra forense. [15]
Otra aplicación de la CE en ciencia forense es el análisis de tintas, donde el análisis de las tintas de impresión por inyección de tinta se está volviendo más necesario debido a la cada vez más frecuente falsificación de documentos impresos por impresoras de inyección de tinta. La composición química de las tintas proporciona información muy importante en casos de documentos fraudulentos y billetes falsos. La cromatografía capilar electroforética micelar (MECC) se ha desarrollado y aplicado al análisis de tintas extraídas del papel. Debido a su alto poder de resolución en comparación con tintas que contienen varias sustancias químicamente similares, también se pueden distinguir diferencias entre tintas del mismo fabricante. Esto lo hace adecuado para evaluar el origen de documentos basándose en la composición química de las tintas. Cabe señalar que debido a la posible compatibilidad de un mismo cartucho con diferentes modelos de impresora, la diferenciación de tintas en base a sus perfiles electroforéticos MECC es un método más confiable para determinar el origen del cartucho de tinta (su productor y cartucho). número) en lugar del modelo de impresora de origen. [dieciséis]
Un tipo especializado de CE, la electroforesis capilar de afinidad (ACE), utiliza interacciones de unión intermoleculares para comprender las interacciones proteína-ligando. [17] Las compañías farmacéuticas utilizan ACE por una multitud de razones, siendo una de las principales las constantes de asociación/unión de medicamentos y ligandos o medicamentos y ciertos sistemas de vehículos como micelas . Es una técnica ampliamente utilizada debido a su simplicidad, resultados rápidos y bajo uso de analitos. [18] El uso de ACE puede proporcionar detalles específicos sobre la unión, separación y detección de analitos y ha demostrado ser muy práctico para estudios en ciencias biológicas. La electroforesis capilar de afinidad basada en aptámeros se utiliza para el análisis y modificaciones de reactivos de afinidad específicos. Los aptámeros modificados exhiben idealmente una alta afinidad de unión, especificidad y resistencia a las nucleasas. [19] Ren y cols. incorporaron nucleótidos modificados en aptámeros para introducir nuevas características de confrontación e interacciones de alta afinidad de las interacciones hidrofóbicas y polares entre IL-1α y el aptámero. [20] Huang et al. utiliza ACE para investigar las interacciones proteína-proteína utilizando aptámeros. Se marcó un aptámero de unión a trombina α con 6-carboxifluoresceína para su uso como sonda fluorescente selectiva y se estudió para dilucidar información sobre los sitios de unión para las interacciones proteína-proteína y proteína-ADN. [21]
La electroforesis capilar (CE) se ha convertido en un enfoque importante y rentable para realizar la secuenciación de ADN que proporciona información de secuenciación de alto rendimiento y alta precisión. Woolley y Mathies utilizaron un chip CE para secuenciar fragmentos de ADN con una precisión del 97% y una velocidad de 150 bases en 540 segundos. [22] Utilizaron un formato de detección y etiquetado de 4 colores para recopilar datos fluorescentes. La fluorescencia se utiliza para ver las concentraciones de cada parte de la secuencia de ácido nucleico, A, T, C y G, y estos picos de concentración que se representan gráficamente a partir de la detección se utilizan para determinar la secuencia del ADN. [22]
