La criopreservación o crioconservación es un proceso en el que el material biológico ( células , tejidos u órganos ) se congela para preservar el material durante un período de tiempo prolongado. [1] A bajas temperaturas (normalmente -80 °C (-112 °F) o -196 °C (-321 °F) usando nitrógeno líquido ) se detiene eficazmente cualquier metabolismo celular que pueda causar daños al material biológico en cuestión. La criopreservación es una forma eficaz de transportar muestras biológicas a largas distancias, almacenar muestras durante períodos de tiempo prolongados y crear un banco de muestras para los usuarios. Se añaden moléculas, denominadas agentes crioprotectores (CPA), para reducir el shock osmótico y el estrés físico que sufren las células en el proceso de congelación. [2] Algunos agentes crioprotectores utilizados en la investigación están inspirados en plantas y animales de la naturaleza que tienen una tolerancia al frío única para sobrevivir a los duros inviernos, incluidos: árboles, [3] [4] ranas de bosque, [5] y tardígrados. [6]
Los tardígrados , organismos microscópicos multicelulares, pueden sobrevivir a la congelación reemplazando la mayor parte de su agua interna con un azúcar llamado trehalosa , evitando su cristalización que de otro modo dañaría las membranas celulares . Las mezclas de solutos pueden lograr efectos similares. Algunos solutos, incluidas las sales, tienen la desventaja de que pueden resultar tóxicos en concentraciones intensas. Además del oso de agua, las ranas arbóreas pueden tolerar la congelación de su sangre y otros tejidos. La urea se acumula en los tejidos en preparación para el invierno y el glucógeno hepático se convierte en grandes cantidades en glucosa en respuesta a la formación de hielo interno. Tanto la urea como la glucosa actúan como " crioprotectores " para limitar la cantidad de hielo que se forma y reducir la contracción osmótica de las células. Las ranas pueden sobrevivir a muchos eventos de congelación/descongelación durante el invierno si no se congela más del 65% del agua total del cuerpo. La investigación que explora el fenómeno de las "ranas congeladas" ha sido realizada principalmente por el investigador canadiense Dr. Kenneth B. Storey . [ cita necesaria ]
La tolerancia a las heladas , en la que los organismos sobreviven al invierno congelando sólidos y cesando sus funciones vitales, se conoce en unos pocos vertebrados: cinco especies de ranas ( Rana sylvatica , Pseudacris triseriata , Hyla crucifer , Hyla versicolor , Hyla chrysoscelis ), una de salamandras ( Salamandrella llaveserlingii ), uno de serpientes ( Thamnophis sirtalis ) y tres de tortugas ( Chrysemys picta , Terrapene carolina , Terrapene ornata ). [7] Las tortugas mordedoras Chelydra serpentina y las lagartijas Podarcis muralis también sobreviven a la congelación nominal, pero no se ha establecido que sean adaptables para pasar el invierno. En el caso de Rana sylvatica, un criopreservante es la glucosa ordinaria, cuya concentración aumenta en aproximadamente 19 mmol/L cuando las ranas se enfrían lentamente. [7]
Uno de los primeros teóricos de la criopreservación fue James Lovelock . En 1953, sugirió que el daño a los glóbulos rojos durante la congelación se debía al estrés osmótico [8] y que aumentar la concentración de sal en una célula deshidratada podría dañarla. [9] [10] A mediados de la década de 1950, experimentó con la criopreservación de roedores y determinó que los hámsteres podían congelarse con el 60% del agua del cerebro cristalizada en hielo sin efectos adversos; Se demostró que otros órganos eran susceptibles a sufrir daños. [11]
La criopreservación se aplicó a materiales humanos a partir de 1954 con tres embarazos resultantes de la inseminación de esperma previamente congelado. [12] El esperma de ave fue criopreservado en 1957 por un equipo de científicos en el Reino Unido dirigido por Christopher Polge . [13] Durante 1963, Peter Mazur, en el Laboratorio Nacional de Oak Ridge en los EE. UU., demostró que se podía evitar la congelación intracelular letal si el enfriamiento era lo suficientemente lento como para permitir que saliera suficiente agua de la célula durante la congelación progresiva del líquido extracelular. Esa velocidad difiere entre células de diferentes tamaños y permeabilidad al agua: una velocidad de enfriamiento típica de alrededor de 1 °C/minuto es apropiada para muchas células de mamíferos después del tratamiento con crioprotectores como glicerol o dimetilsulfóxido, pero la velocidad no es un óptimo universal. [14]
El 22 de abril de 1966, se congeló el primer cadáver humano (había sido embalsamado durante dos meses) colocándolo en nitrógeno líquido y almacenándolo justo por encima del punto de congelación. El cadáver era el de una anciana de Los Ángeles, cuyo nombre se desconoce, y pronto fue descongelado y enterrado por sus familiares. El primer cadáver humano congelado con la esperanza de una futura resurrección fue el de James Bedford , pocas horas después de su muerte causada por cáncer en 1967. [15] El de Bedford es el único cadáver criónico congelado antes de 1974 que todavía está congelado hoy. [dieciséis]
Los fenómenos que pueden causar daño a las células durante la criopreservación ocurren principalmente durante la etapa de congelación e incluyen efectos de la solución, formación de hielo extracelular , deshidratación y formación de hielo intracelular . Muchos de estos efectos pueden reducirse con crioprotectores. Una vez que el material conservado se ha congelado, está relativamente a salvo de daños mayores. [17]
Las principales técnicas para prevenir los daños a la criopreservación son una combinación bien establecida de velocidad controlada y congelación lenta y un proceso más nuevo de congelación instantánea conocido como vitrificación .
La congelación lenta y de velocidad controlada , también conocida como congelación lenta programable (SPF) , [18] es una técnica en la que las células se enfrían a alrededor de -196 °C en el transcurso de varias horas.
La congelación lenta y programable se desarrolló a principios de la década de 1970 y, finalmente, dio lugar al primer nacimiento de un embrión humano congelado en 1984. Desde entonces, se han utilizado máquinas que congelan muestras biológicas utilizando secuencias programables o velocidades controladas para la biología humana, animal y celular. – "congelar" una muestra para conservarla mejor para su eventual descongelación, antes de congelarla o criopreservarla en nitrógeno líquido. Estas máquinas se utilizan para congelar ovocitos, piel, productos sanguíneos, embriones, espermatozoides, células madre y conservación general de tejidos en hospitales, consultorios veterinarios y laboratorios de investigación de todo el mundo. A modo de ejemplo, el número de nacimientos vivos a partir de embriones congelados 'lentamente congelados' se estima entre 300.000 y 400.000, o el 20% de los 3 millones de nacimientos estimados mediante fertilización in vitro (FIV). [19]
La congelación intracelular letal se puede evitar si el enfriamiento es lo suficientemente lento como para permitir que salga suficiente agua de la célula durante la congelación progresiva del líquido extracelular. Para minimizar el crecimiento de cristales de hielo extracelulares y la recristalización, [20] se pueden utilizar biomateriales como alginatos , alcohol polivinílico o quitosano para impedir el crecimiento de los cristales de hielo junto con crioprotectores tradicionales de moléculas pequeñas. [21] Esa velocidad difiere entre células de diferentes tamaños y permeabilidad al agua : una velocidad de enfriamiento típica de aproximadamente 1 °C/minuto es apropiada para muchas células de mamíferos después del tratamiento con crioprotectores como glicerol o dimetilsulfóxido (DMSO), pero la velocidad es no es un óptimo universal. La velocidad de 1 °C/minuto se puede lograr utilizando dispositivos como un congelador con velocidad controlada o un recipiente congelador portátil de mesa. [22]
Varios estudios independientes han proporcionado evidencia de que los embriones congelados almacenados mediante técnicas de congelación lenta pueden, en cierto modo, ser "mejores" que los frescos en FIV. Los estudios indican que el uso de embriones y óvulos congelados en lugar de embriones y óvulos frescos redujo el riesgo de muerte fetal y parto prematuro, aunque aún se están explorando las razones exactas.
La vitrificación es un proceso de congelación instantánea (enfriamiento ultrarrápido) que ayuda a prevenir la formación de cristales de hielo y ayuda a prevenir daños por criopreservación.
Los investigadores Greg Fahy y William F. Rall ayudaron a introducir la vitrificación en la criopreservación reproductiva a mediados de los años 1980. [23] A partir del año 2000, los investigadores afirman que la vitrificación proporciona los beneficios de la criopreservación sin daños debido a la formación de cristales de hielo. [24] La situación se volvió más compleja con el desarrollo de la ingeniería de tejidos, ya que tanto las células como los biomateriales deben permanecer libres de hielo para preservar la alta viabilidad y funciones celulares, la integridad de las construcciones y la estructura de los biomateriales. La vitrificación de construcciones de ingeniería tisular fue reportada por primera vez por Lilia Kuleshova, [25] quien también fue la primera científica en lograr la vitrificación de ovocitos , lo que resultó en un nacimiento vivo en 1999. [26] Para la criopreservación clínica, la vitrificación generalmente requiere la adición de crioprotectores antes. enfriamiento. Los crioprotectores son macromoléculas que se agregan al medio de congelación para proteger a las células de los efectos perjudiciales de la formación de cristales de hielo intracelulares o de los efectos de la solución, durante el proceso de congelación y descongelación. Permiten un mayor grado de supervivencia celular durante la congelación, para reducir el punto de congelación y para proteger la membrana celular de daños relacionados con la congelación. Los crioprotectores tienen alta solubilidad, baja toxicidad en altas concentraciones, bajo peso molecular y la capacidad de interactuar con el agua mediante enlaces de hidrógeno.
En lugar de cristalizar , la solución almibarada se convierte en hielo amorfo : se vitrifica . En lugar de un cambio de fase de líquido a sólido por cristalización, el estado amorfo es como un "líquido sólido" y la transformación se produce en un pequeño rango de temperatura descrito como temperatura de " transición vítrea ".
La vitrificación del agua se promueve mediante un enfriamiento rápido y se puede lograr sin crioprotectores mediante una disminución extremadamente rápida de la temperatura (megakelvins por segundo). El ritmo necesario para alcanzar el estado vítreo en agua pura se consideraba imposible hasta 2005. [27]
Dos condiciones que normalmente se requieren para permitir la vitrificación son un aumento de la viscosidad y una disminución de la temperatura de congelación. Muchos solutos hacen ambas cosas, pero las moléculas más grandes generalmente tienen un efecto mayor, particularmente en la viscosidad. El enfriamiento rápido también promueve la vitrificación.
Para los métodos establecidos de criopreservación, el soluto debe penetrar la membrana celular para lograr una mayor viscosidad y disminuir la temperatura de congelación dentro de la célula. Los azúcares no atraviesan fácilmente la membrana. Los solutos que lo hacen, como el DMSO, un crioprotector común, suelen ser tóxicos en concentraciones intensas. Uno de los compromisos difíciles de la criopreservación vitrificada es limitar el daño producido por el propio crioprotector debido a su toxicidad. Las mezclas de crioprotectores y el uso de bloqueadores de hielo han permitido a la empresa 21st Century Medicine vitrificar un riñón de conejo a -135 °C con su mezcla de vitrificación patentada. Tras el recalentamiento, el riñón se trasplantó con éxito a un conejo, con completa funcionalidad y viabilidad, capaz de sostener al conejo indefinidamente como único riñón en funcionamiento. [28] En 2000, FM-2030 se convirtió en la primera persona vitrificada con éxito de forma póstuma.
La sangre se puede reemplazar con gases nobles inertes y/o gases metabólicamente vitales como el oxígeno , de modo que los órganos puedan enfriarse más rápidamente y se necesite menos anticongelante. Dado que las regiones del tejido están separadas por gas, las pequeñas expansiones no se acumulan, protegiendo así contra la rotura. [29] Una pequeña empresa, Arigos Biomedical, "ya ha recuperado corazones de cerdo a 120 grados bajo cero", [30] aunque la definición de "recuperado" no está clara. Presiones de 60 atm pueden ayudar a aumentar las tasas de intercambio de calor. [31] La perfusión/persuflación de oxígeno gaseoso puede mejorar la preservación de órganos en relación con el almacenamiento en frío estático o la perfusión con máquina hipotérmica, ya que la menor viscosidad de los gases puede ayudar a llegar a más regiones de órganos preservados y suministrar más oxígeno por gramo de tejido. [32]
Generalmente, la criopreservación es más fácil para muestras delgadas y células suspendidas, porque pueden enfriarse más rápidamente y, por lo tanto, requieren dosis menores de crioprotectores tóxicos . Por lo tanto, la criopreservación de hígados y corazones humanos para su almacenamiento y trasplante sigue siendo poco práctica.
Sin embargo, las combinaciones adecuadas de crioprotectores y regímenes de enfriamiento y enjuague durante el calentamiento a menudo permiten la criopreservación exitosa de materiales biológicos, particularmente suspensiones celulares o muestras de tejido delgadas. Ejemplos incluyen:
La criopreservación de embriones se utiliza para el almacenamiento de embriones, por ejemplo, cuando la FIV ha dado como resultado más embriones de los que se necesitan actualmente.
Se ha informado de un embarazo y el consiguiente nacimiento saludable de un embrión almacenado durante 27 años, después del embarazo exitoso de un embrión del mismo lote tres años antes. [37] Muchos estudios han evaluado a los niños nacidos de embriones congelados o "frosties". El resultado ha sido uniformemente positivo, sin aumento de defectos de nacimiento o anomalías del desarrollo. [38] Un estudio de más de 11.000 embriones humanos criopreservados no mostró ningún efecto significativo del tiempo de almacenamiento en la supervivencia después de la descongelación para ciclos de FIV o de donación de ovocitos, o para embriones congelados en las etapas pronuclear o de escisión. [39] Además, la duración del almacenamiento no tuvo ningún efecto significativo sobre el embarazo clínico, el aborto espontáneo, la implantación o la tasa de nacidos vivos, ya sea por ciclos de FIV o de donación de ovocitos. [39] Más bien, la edad de los ovocitos, la proporción de supervivencia y el número de embriones transferidos son factores predictivos del resultado del embarazo. [39]
La criopreservación del tejido ovárico es de interés para las mujeres que desean preservar su función reproductiva más allá del límite natural, o cuyo potencial reproductivo está amenazado por la terapia contra el cáncer, [40] por ejemplo en neoplasias hematológicas o cáncer de mama. [41] El procedimiento consiste en tomar una parte del ovario y realizar una congelación lenta antes de almacenarlo en nitrógeno líquido mientras se realiza la terapia. Luego, el tejido se puede descongelar e implantar cerca de la trompa de Falopio, ya sea ortotópico (en la ubicación natural) o heterotópico (en la pared abdominal), [41] donde comienza a producir nuevos óvulos, lo que permite que se produzca una concepción normal. [42] El tejido ovárico también se puede trasplantar a ratones inmunocomprometidos ( ratones SCID ) para evitar el rechazo del injerto , y el tejido se puede recolectar más tarde, cuando se hayan desarrollado los folículos maduros. [43]
La criopreservación de ovocitos humanos es una nueva tecnología en la que se extraen, congelan y almacenan óvulos ( ovocitos ) de una mujer. Más tarde, cuando esté lista para quedar embarazada, los óvulos se pueden descongelar, fertilizar y transferir al útero como embriones . Desde 1999, cuando Kuleshova y sus colaboradores informaron en la revista Human Reproduction sobre el nacimiento del primer bebé a partir de un embrión derivado de óvulos de mujer vitrificados y calentados, [25] este concepto ha sido reconocido y generalizado. Este avance en el logro de la vitrificación de los ovocitos de una mujer supuso un avance importante en nuestro conocimiento y práctica del proceso de FIV, ya que la tasa de embarazo clínico es cuatro veces mayor después de la vitrificación de los ovocitos que después de la congelación lenta. [44] La vitrificación de ovocitos es vital para preservar la fertilidad en pacientes oncológicos jóvenes y para personas sometidas a FIV que se oponen, ya sea por razones religiosas o éticas, a la práctica de congelar embriones.
El semen se puede utilizar con éxito casi indefinidamente después de la criopreservación. El almacenamiento exitoso más largo reportado es de 22 años. [45] Puede usarse para la donación de esperma cuando el receptor desea el tratamiento en un momento o lugar diferente o como un medio para preservar la fertilidad en hombres sometidos a vasectomía o tratamientos que puedan comprometer su fertilidad, como quimioterapia , radioterapia o cirugía.
La criopreservación de tejido testicular inmaduro es un método en desarrollo para aprovechar la reproducción en niños pequeños que necesitan terapia gonadotóxica. Los datos en animales son prometedores, ya que se han obtenido crías sanas tras el trasplante de suspensiones de células testiculares congeladas o trozos de tejido. Sin embargo, ninguna de las opciones de restauración de la fertilidad a partir de tejido congelado, es decir, el trasplante de suspensión celular, el injerto de tejido y la maduración in vitro, ha demostrado hasta el momento ser eficaz y segura en humanos. [46]
La criopreservación de plantas enteras de musgo , especialmente Physcomitrella patens , ha sido desarrollada por Ralf Reski y colaboradores [47] y se lleva a cabo en el International Moss Stock Center . Este biobanco recolecta, preserva y distribuye musgos mutantes y ecotipos de musgos . [48]
Las MSC, cuando se transfunden inmediatamente unas pocas horas después de la descongelación, pueden mostrar una función reducida o una eficacia reducida en el tratamiento de enfermedades en comparación con aquellas MSC que se encuentran en la fase logarítmica de crecimiento celular (frescas). Como resultado, las MSC criopreservadas deben volver a la fase logarítmica de crecimiento celular en cultivo in vitro antes de administrarlas para ensayos clínicos o terapias experimentales. El nuevo cultivo de MSC ayudará a recuperarse del shock que sufren las células durante la congelación y descongelación. Varios ensayos clínicos con MSC que utilizaron productos criopreservados inmediatamente después de la descongelación han fracasado en comparación con los ensayos clínicos que utilizaron MSC frescas. [49]
La criopreservación de plantas se está volviendo vital por su valor de biodiversidad. Las semillas a menudo se consideran un importante sistema de transmisión de información genética. La criopreservación de semillas recalcitrantes es la más difícil debido a la intolerancia a las bajas temperaturas y al bajo contenido de agua. Sin embargo, la solución de vitrificación de plantas puede resolver el problema y ayudar a criopreservar semillas recalcitrantes (Nymphaea caerulea). [50]
Las bacterias y los hongos se pueden mantener refrigerados por un corto plazo (de meses a aproximadamente un año, dependiendo); sin embargo, la división celular y el metabolismo no se detienen por completo y, por lo tanto, no son una opción óptima para el almacenamiento a largo plazo (años) o para preservar cultivos genéticamente. o fenotípicamente, ya que las divisiones celulares pueden provocar mutaciones o el subcultivo puede provocar cambios fenotípicos. Una opción preferida, que depende de la especie, es la criopreservación. Los gusanos nematodos son los únicos eucariotas multicelulares que se ha demostrado que sobreviven a la criopreservación. [51] [52]
Los hongos, en particular los zigomicetos, los ascomicetos y los basidiomicetos superiores, independientemente de su esporulación, pueden almacenarse en nitrógeno líquido o congelarse. La criopreservación es un método característico para los hongos que no esporulan (de lo contrario, se pueden usar otros métodos de conservación de esporas a menor costo y facilidad), esporulan pero tienen esporas delicadas (grandes o sensibles a la liofilización), son patógenos (peligrosos para mantenerse metabólicamente activos). hongo) o se van a utilizar para reservas genéticas (lo ideal es que tengan una composición idéntica a la del depósito original). Como ocurre con muchos otros organismos, se utilizan crioprotectores como DMSO o glicerol (por ejemplo, hongos filamentosos con un 10 % de glicerol o levadura con un 20 % de glicerol). Las diferencias entre la elección de crioprotectores dependen de la especie (o clase), pero generalmente para los hongos los crioprotectores penetrantes como DMSO, glicerol o polietilenglicol son los más efectivos (otros no penetrantes incluyen azúcares manitol, sorbitol, dextrano, etc.). No se recomienda la repetición de congelación y descongelación ya que puede disminuir la viabilidad. Se recomiendan congeladores de respaldo o sitios de almacenamiento de nitrógeno líquido. A continuación se resumen varios protocolos de congelación (cada uno utiliza criotubos de polipropileno con tapa de rosca): [53]
Muchas cepas cultivables de laboratorio comunes se congelan para preservar reservas genética y fenotípicamente estables a largo plazo. [54] El subcultivo y las muestras refrigeradas prolongadas pueden provocar la pérdida de plásmidos o mutaciones. Los porcentajes finales comunes de glicerol son 15, 20 y 25. De una placa de cultivo nueva, se elige una única colonia de interés y se realiza un cultivo líquido. Del cultivo líquido, el medio se mezcla directamente con una cantidad igual de glicerol; La colonia debe ser revisada para detectar defectos como mutaciones. Todos los antibióticos deben eliminarse del cultivo antes del almacenamiento a largo plazo. Los métodos varían, pero la mezcla se puede realizar suavemente mediante inversión o rápidamente mediante vórtex y el enfriamiento puede variar colocando el criotubo directamente entre -50 y -95 °C, congelándolo en nitrógeno líquido o enfriándolo gradualmente y luego almacenándolo a -80 °C. C o más frío (nitrógeno líquido o vapor de nitrógeno líquido). La recuperación de bacterias también puede variar, es decir, si las perlas se almacenan dentro del tubo, entonces se pueden usar unas pocas perlas para sembrar o se puede raspar el material congelado con un bucle y luego se sembrar; sin embargo, dado que solo se necesita poco material para todo el tubo nunca debe descongelarse por completo y se deben evitar repetidas operaciones de congelación y descongelación. La recuperación del 100% no es factible independientemente de la metodología. [55] [56] [57]
Los nemátodos microscópicos que habitan en el suelo, Panagrolaimus detritophagus y Plectus parvus, son los únicos organismos eucariotas que han demostrado ser viables después de una criopreservación a largo plazo hasta la fecha. En este caso, la conservación fue natural y no artificial, debido al permafrost .
Se ha demostrado que varias especies animales, incluidos peces, anfibios y reptiles, toleran la congelación. Al menos cuatro especies de ranas ( Pseudacris crucifer , Hyla versicolor , Pseudacris triseriata , Lithobates sylvaticus ) y varias especies de tortugas ( Terrapene carolina , crías de Chrysemys picta ), lagartos y serpientes son tolerantes a las heladas y han desarrollado adaptaciones para sobrevivir a las heladas. Si bien algunas ranas hibernan bajo tierra o en el agua, la temperatura corporal aún baja de -5 a -7 °C, lo que provoca que se congelen. La rana de bosque ( Lithobates sylvaticus ) puede resistir heladas repetidas, durante las cuales alrededor del 65% de su líquido extracelular se convierte en hielo. [54]
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