stringtranslate.com

Marcador de tamaño de peso molecular

Un marcador de tamaño de peso molecular en forma de escalera de ADN de 1 kb en el carril más a la derecha, utilizado en electroforesis en gel. Las condiciones del gel son agarosa al 1%, 3 voltios /cm y tinción con bromuro de etidio .

Un marcador de tamaño de peso molecular , también conocido como escalera de proteínas , escalera de ADN o escalera de ARN , es un conjunto de estándares que se utilizan para identificar el tamaño aproximado de una molécula procesada en un gel durante la electroforesis , utilizando el principio de que El peso es inversamente proporcional a la tasa de migración a través de una matriz de gel. Por lo tanto, cuando se utilizan en electroforesis en gel , los marcadores proporcionan efectivamente una escala logarítmica mediante la cual estimar el tamaño de los otros fragmentos (siempre que se conozcan los tamaños de los fragmentos del marcador).

Se encuentran disponibles comercialmente marcadores de proteínas, ADN y ARN con tamaños y concentraciones de fragmentos predeterminados. Estos pueden ejecutarse en geles de agarosa o poliacrilamida . Los marcadores se cargan en carriles adyacentes a los carriles de muestra antes del comienzo de la ejecución.

marcadores de ADN

Gel sometido a electroforesis con escaleras de ADN de diferentes longitudes en el carril izquierdo y en el carril central. Los tamaños de los fragmentos están marcados a la derecha, en pares de bases .

Desarrollo

Aunque se ha mantenido el concepto de marcadores de peso molecular, las técnicas de desarrollo han variado a lo largo de los años. Los nuevos inventos de marcadores de peso molecular se distribuyen en kits específicos para el tipo de marcador.

Uno de los primeros problemas en el desarrollo de marcadores fue lograr una alta resolución en toda la longitud del marcador. [1] Dependiendo de las condiciones de funcionamiento de la electroforesis en gel, es posible que los fragmentos se hayan comprimido, alterando la claridad. Para abordar este problema, en 1990 se desarrolló un kit para análisis Southern Blot , que proporcionó el primer marcador que combina ADN objetivo y ADN sonda. Esta técnica aprovechó el espaciado logarítmico y podría usarse para identificar bandas objetivo con una longitud de más de 20.000 nucleótidos . [2]

Diseño

Existen dos métodos comunes para construir un marcador de tamaño de peso molecular de ADN. [3] Uno de esos métodos emplea la técnica de ligadura parcial . [3] La ligadura del ADN es el proceso mediante el cual piezas lineales de ADN se conectan entre sí mediante enlaces covalentes ; más concretamente, estos enlaces son enlaces fosfodiéster . [4] Aquí, un fragmento de ADN dúplex de 100 pb está parcialmente ligado. La consecuencia de esto es que se formarán dímeros de 200 pb, trímeros de 300 pb, tetrámeros de 400 pb, pentámeros de 500 pb, etc. Además, quedará una parte del dsDNA de 100 pb. Como resultado, se crea en el gel una "escalera" de ADN compuesta de fragmentos de ADN de masa molecular conocida. [3]

El segundo método emplea el uso de enzimas de restricción y una secuencia de ADN reconocida. [3] El ADN es digerido por una enzima de restricción particular, lo que da como resultado fragmentos de ADN de diferentes masas moleculares. Una de las ventajas de este método es que se pueden crear fácilmente más marcadores simplemente digiriendo más ADN conocido. [3] Por otro lado, el tamaño de los trozos de ADN se basa en los sitios donde corta la enzima de restricción. Esto hace que sea más difícil controlar el tamaño de los fragmentos en el marcador. [5]

Más recientemente, los laboratorios están empleando otro método para construir marcadores de tamaño de peso molecular del ADN. Esta estrategia implica el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . [5] Esto se logra de una o dos maneras: 1) un objetivo de ADN se amplifica al mismo tiempo mediante conjuntos de cebadores , o 2) diferentes objetivos de ADN se amplifican de forma independiente mediante cebadores particulares. [5]

Efectos de las condiciones del gel.

Al igual que con las muestras experimentales, las condiciones del gel pueden afectar el marcador de tamaño de peso molecular que se encuentra a su lado. Factores como el buffer , la carga/ voltaje y la concentración del gel pueden afectar la movilidad y/o la apariencia de su marcador/escalera/estándar. Estos elementos deben tenerse en cuenta al seleccionar un marcador y al analizar los resultados finales en un gel.

Gel de agarosa al 1,2% que muestra dos escaleras de ADN diferentes teñidas con tinción GelRed
Amortiguadores
Los tampones actúan para 1) establecer el pH y 2) proporcionar iones para respaldar la conductividad. En la electroforesis de ADN , el TAE (Tris-acetato-EDTA) y el TBE (Tris-borato-EDTA) son los tampones de elección habituales. [6] Se prefiere el tampón TBE para fragmentos pequeños de ADN, mientras que TAE es más adecuado para fragmentos de más de 1500 pares de bases. En términos de capacidad de amortiguación, TAE es menor en comparación con TBE; esto generalmente resulta en una movilidad más lenta del ADN. TBE también es capaz de ofrecer una mejor resolución. [7]
Cabe señalar que el agua no puede actuar como sustituto de uno de estos tampones, ya que el ADN no migrará a lo largo del gel. [6] Además, el uso de agua en lugar de tampón hará que el gel se derrita . [8]
Carga/Voltaje
En términos de voltaje, el rango recomendado es entre 4 y 10 V/cm (es decir, voltios/cm). [8] Los geles de agarosa generalmente funcionan a un voltaje de 5 V/cm. [3] [6] La unidad de distancia, cm , se refiere a la distancia entre los electrodos (es decir, el ánodo y el cátodo ) y no a la longitud del gel en sí. [3] [6]
Los voltajes muy por debajo o por encima de este rango afectarán la movilidad y la resolución de las bandas. Los voltajes bajos disminuirán la movilidad y harán que las bandas se ensanchen. Por otro lado, los altos voltajes disminuirán la resolución de las bandas. Esto se debe en gran medida al hecho de que voltajes demasiado altos pueden hacer que el gel se sobrecaliente e incluso se derrita. [8]
Concentración
Se debe tener en cuenta la concentración de agarosa al seleccionar un marcador. El porcentaje de gel afecta la migración del ADN. [3] [6] Generalmente, cuanto mayor sea la concentración del gel, más lenta será la velocidad a la que el ADN se moverá a través del gel. Esto se suma al papel que juega el peso molecular en la migración de un marcador o muestra de ADN, es decir, que cuanto mayor sea el peso molecular, más lento migrará el ADN. [3] [6]
La concentración del gel también afecta la capacidad de visualizar las bandas agotadas en el gel. Las bandas más pequeñas se resuelven mejor en un gel con un porcentaje más alto, mientras que las bandas de mayor peso molecular se visualizan más fácilmente en un gel con un porcentaje más bajo. [6]

Marcadores de proteínas

Desarrollo

Anteriormente, los marcadores de proteínas se habían desarrollado utilizando una variedad de proteínas enteras. El desarrollo de un kit que incluía un marcador de tamaño de peso molecular basado en fragmentos de proteínas comenzó en 1993. Este marcador de proteínas, compuesto por 49 secuencias de aminoácidos diferentes , incluía proteínas multidominio y permitía el análisis de proteínas escindidas en diferentes sitios. [9]

Las mejoras técnicas actuales en los marcadores de proteínas implican el uso del desarrollo automático. El primer marcador de proteína de peso regular desarrollado automáticamente se inventó en 2012. [10]

Diseño

Al igual que los marcadores de ADN, estos marcadores suelen estar compuestos de proteínas purificadas cuyas masas moleculares ya se conocen. [3] La siguiente lista describe algunas de las proteínas, así como la masa molecular, que se utilizan comúnmente al construir un marcador de proteína.

Inmunoblot con escalera de proteínas en el carril más a la izquierda. Los tamaños de los fragmentos se miden en kDa ( kilodaltons ).

Elegir el marcador de proteínas correcto

Los marcadores de tamaño de peso molecular se pueden dividir en dos categorías: marcadores de peso molecular versus marcadores de escalera molecular. [14] Los marcadores están teñidos o sin teñir y, según las circunstancias, uno puede ser más apropiado que otro. Los marcadores de tamaño de peso molecular también pueden alterarse bioquímicamente. [15] La conjugación con biotina es la más común. Los marcadores de tamaño de peso molecular se utilizan con mayor frecuencia en electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y transferencia Western . Con todos los diferentes tipos y usos de marcadores de tamaño de peso molecular, es importante elegir el estándar de proteína apropiado. Además del uso más común, como forma de calcular el peso molecular de las muestras, otros usos incluyen permitir evidencia visual de la migración de proteínas y la eficiencia de la transferencia y, a veces, incluso se usan para control positivo. [dieciséis]

Marcador MW frente a escaleras de proteínas
Un marcador de peso molecular es un tipo de estándar de proteína. Pueden teñirse previamente o no antes de la carga; Dependiendo del tipo de experimento, uno puede ser más ventajoso. En cualquier caso, normalmente se procesan en el carril exterior de un gel, mientras que la muestra se carga en los carriles centrales. [14] Los marcadores moleculares se diferencian de las escaleras de proteínas en que están compuestos de una mezcla de proteínas nativas cuyas especificaciones están bien categorizadas pero no corresponden a números enteros. [14] Generalmente son mucho más baratos, pero el análisis sólo permite un valor aproximado de las proteínas separadas por electroforesis. [14]
Una escalera de proteínas es otro tipo de estándar de proteínas. Casi siempre están manchados. [14] Las escaleras de proteínas se diferencian de los marcadores moleculares en que están compuestas de una mezcla de proteínas altamente purificadas cuyas especificaciones son conocidas y corresponden a números enteros. [14] Generalmente las escaleras de proteínas se componen de 10 a 12 proteínas. [14] Al final del experimento, después de que se produzca la migración de tamaño, una sola banda representará el tamaño de cada proteína contenida en la escalera. [17] Los marcadores están espaciados uniformemente y el análisis de tamaño utilizando estos marcadores permite un valor preciso de la proteína de interés. En algunos casos, como método de confirmación molecular, los marcadores MW se ejecutan con escaleras de proteínas para su verificación. [14]
Marcadores preteñidos y sin teñir
Los marcadores de proteínas pueden venir sin teñir o preteñidos, pero ambos tienen sus ventajas y desventajas. [18] La visualización sencilla de la separación y transferencia de proteínas es posible mediante el uso de marcadores preteñidos. [18] Se utilizan comúnmente tanto en electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS como en transferencia Western. En SDS-PAGE permite el seguimiento de la migración de proteínas, ya que las bandas de proteínas se separarán y podrán verse durante una ejecución electroforética. En las transferencias Western, los estándares de proteínas teñidas permiten la visualización de la transferencia de proteínas a la membrana. [17] Sin embargo, las determinaciones de tamaño no son tan precisas con estos marcadores (consulte la sección Marcadores naturales y recombinantes para obtener más explicaciones). [18]
Si bien los marcadores sin teñir permiten determinaciones de tamaño más exactas, no se pueden ver mientras el gel está funcionando. Como tal, el gel debe teñirse para poder visualizar las bandas. [19]
Marcadores recombinantes y naturales
Además de los marcadores teñidos y sin teñir, los marcadores de proteínas pueden considerarse en términos de recombinantes y naturales. [18] Los marcadores recombinantes consisten en proteínas recombinantes que han sido altamente purificadas. Estos marcadores están diseñados de tal manera que resaltan características particulares. [18] Ejemplos de estas características incluyen etiquetas de afinidad y pesos moleculares que están colocados uniformemente entre sí. [18]
Los marcadores naturales, como su nombre indica, son una mezcla de proteínas que se producen de forma natural. [18] Los marcadores naturales preteñidos funcionan bien para la visualización de la separación del gel. Sin embargo, estos marcadores tienden a unirse a la mancha de forma covalente en cantidades variables y en diversas posiciones. [18] En consecuencia, las bandas resultantes pueden ser más amplias. Esto es especialmente cierto cuando se hacen comparaciones con marcadores recombinantes preteñidos. Debido a este efecto, es probable que las determinaciones del peso molecular sean menos precisas con los marcadores naturales preteñidos. [18]
Alterado Bioquímicamente
Los estándares de proteínas también pueden alterarse químicamente. Una alteración común es mediante el uso de biotina . La biotina tiene una afinidad muy alta por la estreptavidina y, por tanto, la unión forma un complejo muy fuerte. Para la visualización, se adjunta una etiqueta de color a la estreptavidina. [15]

Efectos de las condiciones del gel.

Al igual que con la electroforesis de ADN, se deben tener en cuenta condiciones como los tampones, la carga/voltaje y la concentración al seleccionar un marcador de proteína.

Amortiguadores
Los tampones pueden afectar la movilidad tanto del marcador como de las muestras. El pH del tampón varía con el sistema utilizado y en consecuencia, cada sistema tampón tendrá un efecto diferente de la carga de una proteína o proteínas. [20] Además, en el caso de SDS-PAGE, la afinidad de unión por SDS puede verse afectada por el sistema de amortiguación. [20] Incluso cuando se utiliza el mismo porcentaje y tipo de gel, las mismas proteínas migrarán a diferentes velocidades dependiendo del tampón utilizado. [20]
Carga/Voltaje
El voltaje juega un papel en la movilidad de las proteínas en un gel. Las proteínas migrarán más rápido a voltajes más altos. En consecuencia, el tiempo de ejecución del gel será más corto. Por el contrario, voltajes más altos pueden dar como resultado una mayor difusión de la banda. [20] Además, si el voltaje es demasiado alto, la temperatura en la cámara de electroforesis puede llegar a ser tal que el gel comience a derretirse. [20]
El voltaje al que se debe utilizar un gel depende del tipo de gel. Para algunos geles, el voltaje permanece constante durante todo el proceso, mientras que, con otros geles, se permite que el voltaje inicial permanezca constante durante un tiempo específico antes de aumentar. [20] Este segundo voltaje se utiliza luego durante un período de tiempo específico, después del cual, también se puede aumentar. [20]
Concentración
En términos de porcentaje, los geles utilizados para la electroforesis de proteínas se pueden dividir en geles de porcentaje único y geles de gradiente. [18] Los geles de un solo porcentaje también se denominan geles lineales. [20] Para geles lineales, el porcentaje seleccionado suele estar entre el 7,5% y el 20%. [18] Los rangos de porcentaje comunes para geles de gradiente son 4-15% y 10-20%. Cada tipo de gel tiene sus propias ventajas. [18] Por ejemplo, se prefieren los geles lineales cuando varias proteínas tienen pesos moleculares similares; Un gel lineal mostrará una mejor separación entre estas proteínas. [18] Por otro lado, los geles de gradiente son una mejor opción cuando las muestras de interés contienen proteínas de pesos moleculares muy diferentes o que cubren una amplia gama de pesos moleculares. [18] [20]

marcadores de ARN

Carril de gel de agarosa sometido a electroforesis que muestra una escalera de ARN con bandas en un rango de 281-6583 pares de bases

Desarrollo

Las escaleras de ARN compuestas por marcadores de tamaño de peso molecular de ARN se desarrollaron inicialmente utilizando el método del círculo sintético [21] para producir marcadores de diferentes tamaños. El inventor Eric T. Kool mejoró esta técnica para utilizar vectores de ADN circulares como método para producir marcadores de tamaño de peso molecular de ARN. Conocido como método del círculo rodante, las mejoras de esta técnica provienen de su eficiencia en la síntesis de oligonucleótidos de ARN . A partir de la plantilla de ADN circular, se puede producir ARN monocatenario de longitud variable entre 4 y 1500 pb sin necesidad de cebadores y reciclando el nucleótido trifosfato . El ADN también se puede sintetizar a partir de la plantilla circular, lo que aumenta la versatilidad de esta técnica. En comparación con la transcripción por escorrentía , el método del círculo sintético produce oligonucleótidos de ARN sin escorrentía. En comparación con la PCR , el método del círculo sintético produce oligonucleótidos de ARN sin necesidad de polimerasa ni termociclador . Este método también es rentable por su capacidad de sintetizar grandes cantidades de producto con una tasa de error menor que los sintetizadores automáticos. [21]

Diseño

Los marcadores de ARN constan de transcritos de ARN de diversas longitudes incrementales. Por ejemplo, el marcador Lonza de 0,5-9 kpb [22] tiene bandas que marcan 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6 y 9 pares de kilobases . Los marcadores se disuelven en un tampón de almacenamiento, como EDTA , y pueden tener una vida útil de hasta 2 años cuando se almacenan a -80 °C. Para utilizar el marcador, como por ejemplo para el análisis de transferencia Northern, primero se descongela y luego se tiñe para que sea detectable en una electroforesis en gel. Uno de los tintes más comunes utilizados para los marcadores es el bromuro de etidio .

El alcance de un marcador particular se refiere a la variedad de bandas que puede mapear. Un rango "alto" se refiere a fragmentos relativamente grandes (medidos en kb), mientras que un rango "bajo" se refiere a marcadores que distinguen entre fragmentos pequeños (medidos en pb). Algunos marcadores pueden incluso describirse como de "rango ultrabajo", [16] pero aún más preciso es el marcador de microARN. Se puede utilizar un marcador de microARN para medir fragmentos de ARN dentro de una docena de nucleótidos, como el marcador de microARN de 17 a 25 nt. [23]

Usar

Con pesos moleculares equivalentes, el ARN migrará más rápido que el ADN. Sin embargo, tanto el ARN como el ADN tienen una pendiente lineal negativa entre su distancia de migración y su peso molecular logarítmico . [24] Es decir, las muestras de menor peso son capaces de migrar una distancia mayor. Esta relación es una consideración al elegir marcadores de ARN o ADN como estándar.

Cuando se procesan marcadores de ARN y muestras de ARN en un gel, es importante evitar la contaminación por nucleasas , ya que el ARN es muy sensible a la degradación de la ribonucleasa (RNasa) mediante catálisis . [25] [26] Por lo tanto, se deben tener en cuenta todos los materiales que se utilizarán en el procedimiento. Cualquier material de vidrio que entre en contacto con el ARN debe tratarse previamente con dietilpirocarbonato (DEPC) y los materiales plásticos deben ser desechables. [25]

Marcadores de tamaño de peso molecular y SDS-PAGE.

Gel SDS-PAGE utilizando un estándar de tamaño de peso molecular en el carril exterior izquierdo

Uno de los usos más comunes de los marcadores de tamaño de peso molecular es la electroforesis en gel. El propósito de la electroforesis en gel es separar proteínas por propiedades físicas o químicas , que incluyen carga, tamaño molecular y pH . < Cuando se separa según el tamaño, el método ideal es SDS-PAGE o electroforesis en gel de poliacrilamida y se utilizan marcadores de tamaño de peso molecular. los estándares apropiados a utilizar.

Los geles pueden variar en tamaño. La cantidad de muestras que se analizarán determinará el tamaño de gel apropiado. Todos los geles se dividen en carriles que discurren paralelos a través del gel. Cada carril contendrá una muestra específica. Normalmente, los estándares de tamaño de peso molecular se colocan en un carril exterior. Si un gel tiene un número particularmente alto de carriles, entonces se pueden colocar varias escaleras a lo largo del gel para lograr una mayor claridad.

Las proteínas y los estándares se pipetean sobre el gel en los carriles apropiados. El dodecilsulfato de sodio (SDS) interactúa con las proteínas, desnaturalizándolas y dándoles una carga negativa. Dado que todas las proteínas tienen la misma relación carga-masa, la movilidad de las proteínas a través del gel se basará únicamente en el peso molecular. Una vez que se activa el campo eléctrico, se iniciará la migración de proteínas. Al finalizar, se puede utilizar un mecanismo de detección como la transferencia Western, que revelará la presencia de bandas. Cada banda representa una proteína específica. La distancia recorrida se basa únicamente en el peso molecular; por lo tanto, el peso molecular de cada proteína se puede determinar comparando la distancia de una proteína desconocida con el estándar de peso molecular conocido. [27]

Diferentes usos de los marcadores de tamaño de peso molecular.

Existen muchos tipos de marcadores de tamaño de peso molecular y cada uno posee características únicas, lo que les permite participar en diversas técnicas biológicas. La selección de un marcador de tamaño de peso molecular depende del tipo de marcador (ADN, ARN o proteína) y del rango de longitud que ofrece (por ejemplo, 1 kb). Antes de seleccionar un marcador de tamaño de peso molecular, es importante familiarizarse con estas características y propiedades. En un caso particular, un tipo puede ser más apropiado que otro. Aunque los marcadores específicos pueden variar entre protocolos para una técnica determinada, esta sección describirá los marcadores generales y sus funciones.

alozimas

El primer tipo de marcador molecular desarrollado y analizado mediante electroforesis en gel fueron las aloenzimas . Estos marcadores se utilizan para la detección de variaciones de proteínas. La palabra "aloenzima" (también conocida como "aloenzima") proviene de " variantes alélicas de enzimas ". [28] Cuando se ejecutan en un gel, las proteínas se separan por tamaño y carga. Aunque las alozimas pueden parecer anticuadas en comparación con otros marcadores disponibles, todavía se utilizan hoy en día, principalmente debido a su bajo costo. Una desventaja importante es que, dado que solo hay una cantidad limitada disponible, la especificidad es un problema. [28]

Marcadores basados ​​en ADN (década de 1960)

Aunque las alozimas pueden detectar variaciones en el ADN, lo hacen mediante un método indirecto y no muy preciso. Los marcadores basados ​​en ADN se desarrollaron en los años 1960. [28] Estos marcadores son mucho más eficaces para distinguir entre variantes de ADN. Hoy en día estos son los marcadores más utilizados. Los marcadores basados ​​en ADN funcionan examinando los nucleótidos, lo que puede cumplir una variedad de funciones, como detectar diferencias en los nucleótidos o incluso cuantificar el número de mutaciones . [28]

RFLP
El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción es una técnica utilizada para detectar variaciones en el ADN homólogo . [29] Las endonucleasas de restricción específicas se utilizan para digerir el ADN. El marcador molecular RFLP es específico de un único fragmento. Junto con los marcadores RFLP alélicos, también se incluye un marcador de tamaño de peso molecular, en este caso un marcador de ADN, [30] en un gel de agarosa sometido a electroforesis . El marcador de ADN permite estimar el tamaño de los fragmentos de restricción.
Minisatélites
Similar al RFLP, esta técnica también utiliza endonucleasas de restricción para digerir el ADN genómico. Los minisatélites son secuencias cortas de repeticiones en tándem, de aproximadamente 10 a 60 pares de bases. Los minisatélites se pueden utilizar para determinar la huella del ADN y como reguladores del control genético. [28]

Marcadores basados ​​en PCR (década de 1980)

El éxito de los marcadores basados ​​en el ADN condujo al desarrollo de la PCR. La PCR ( reacción en cadena de la polimerasa ) es una técnica de amplificación de ADN que se puede aplicar a varios tipos de fragmentos. Antes de este desarrollo, para amplificar el ADN había que clonarlo o aislarlo. Poco después del descubrimiento de la PCR surgió la idea de utilizar marcadores basados ​​en PCR para la electroforesis en gel. Este tipo de marcadores se basan en cebadores de PCR y se clasifican como polimorfismos de secuencia de ADN . [28]

Un gel sometido a electroforesis que muestra productos de PCR. El carril más a la izquierda representa una escalera de ADN con fragmentos a intervalos de 100 pb.
Microsatélites
También conocidos como SSR ( repeticiones de secuencia simple ) o STR ( repeticiones cortas en tándem ), los microsatélites se diferencian de los minisatélites en que son más cortos, generalmente de 2 a 6 pares de bases. Esta propiedad de los microsatélites permite un fácil aislamiento. Los microsatélites se utilizan con mayor frecuencia en genética de poblaciones . Los microsatélites tienen una tasa de mutación alta y compleja, que es su principal desventaja. [28]
AFLP
El polimorfismo de longitud de fragmento amplificado es una técnica de toma de huellas dactilares de ADN basada en PCR . El ADN se digiere primero con endonucleasas. Luego se ligan entre sí los fragmentos de restricción . [31] Luego se genera un marcador molecular cuando se seleccionan fragmentos específicos para la amplificación . Los marcadores AFLP se analizan junto con un marcador de ADN en un gel. Un marcador de ADN AFLP común tiene entre 30 y 330 pb de largo. [32] Los fragmentos de este marcador se encuentran a intervalos de 10 pb para aumentar la precisión.
RAPD
El ADN polimórfico amplificado aleatoriamente es una técnica que se realiza de manera similar al AFLP. La diferencia es que los marcadores moleculares se generan al azar. [31] El marcador de tamaño de peso molecular más común para esta técnica es la escalera de ADN de 1 kb. [33] [34]

Polimorfismo de secuencia de ADN.

Aunque técnicamente hablando, el polimorfismo de la secuencia de ADN ha existido desde el uso del RFLP en la década de 1960, el análisis ha cambiado significativamente a lo largo de los años. El polimorfismo de secuencia de ADN utiliza técnicas más antiguas como RFLP, pero a mayor escala. La secuenciación es mucho más rápida y eficiente. El análisis está automatizado, ya que utiliza una técnica conocida como secuenciación de escopeta. Este método de alto rendimiento se utiliza comúnmente en genética de poblaciones. [28]

SNP
Los SNP ( polimorfismo de un solo nucleótido ) se utilizan para detectar variaciones en nucleótidos individuales. La técnica es muy similar a la de RFLP. Los SNP se utilizan con frecuencia para estudios genéticos de poblaciones. [35] Después de la amplificación mediante PCR, estos pequeños fragmentos se pueden visualizar mediante electroforesis en gel y, nuevamente, los marcadores de ADN desempeñan un papel en la determinación de la longitud de los fragmentos.

Análisis de polisacáridos mediante electroforesis en gel de carbohidratos.

Los marcadores de carbohidratos se emplean en una técnica conocida como análisis de polisacáridos mediante electroforesis en gel de carbohidratos (PACE), que es una técnica de separación mensurable. [36] Permite el análisis de productos de hidrólisis enzimática . [36] Se ha utilizado en aplicaciones tales como caracterización de enzimas involucradas en la degradación de hemicelulosa , determinación de la estructura de polisacáridos de hemicelulosa y análisis de la escisión enzimática de productos de celulosa . [36]

PACE depende de la derivatización, que es la conversión de un compuesto químico en un derivado . [36] [37] Aquí los monosacáridos , oligosacáridos y polisacáridos son los compuestos de interés. Están marcados en sus extremos reductores con una etiqueta fluorescente (es decir, un fluoróforo ). [36] Esta derivatización con un fluoróforo permite tanto la separación en un gel en las circunstancias deseadas como la obtención de imágenes por fluorescencia del gel. En este caso se utiliza un gel de poliacrilamida. [36]

Al igual que con la electroforesis de ADN, ARN y proteínas, los marcadores se analizan junto con las muestras de interés en la electroforesis en gel de carbohidratos. [36] Los marcadores consisten en oligosacáridos de peso molecular conocido. Al igual que las muestras de interés, el marcador también se derivatiza con un fluoróforo (normalmente con ácido 8- aminonaftaleno -1,3,6- trisulfónico (ANTS) o 2- aminoacridona ). [36]

Referencias

  1. ^ Carlson, David P. "Marcadores de tamaño para análisis electroforético de ADN". Patente estadounidense n.º 5316908A . Patentes de Google . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  2. ^ Carlson, David P. "Marcadores de tamaño para análisis electroforético de ADN". Patente EP n.º 0466404B1 . Patentes de Google . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  3. ^ abcdefghijklmnop Blaber, Mike. "Conferencia 20: Electroforesis en gel". BCH5425 Biología Molecular y Biotecnología .
  4. ^ Bowen, R (20 de octubre de 1999). "Ligadura del ADN". Biotecnología e Ingeniería Genética . Consultado el 12 de noviembre de 2013 .
  5. ^ abc Lan, Vo Thi Thuong; Préstamo, Pham Thi Thanh; Duong, Pham Anh Thuy; Thanh, Le Thi; Ja, Ngo Thi; Thuan, Ta Bich (2012). "Procedimiento sencillo para la producción en laboratorio de escalera de ADN". Revista de Ácidos Nucleicos . 2012 : 254630. doi : 10.1155/2012/254630 . PMC 3306978 . PMID  22496965. 
  6. ^ abcdefg Bowen, R. (2000). "Electroforesis de ADN en gel de agarosa". Hipertextos para ciencias biomédicas - Universidad Estatal de Colorado .
  7. ^ "Tampón Tris Borato EDTA y Tris-Acetato-EDTA (TAE y TBE, pH 8,3)" (PDF) . Aniara .
  8. ^ abc "Consejos y trucos de electroforesis en gel de agarosa". Tecnologías de la vida .
  9. ^ Hartley, James. "Escalera de marcadores de tamaño de proteínas". Patente de EE. UU. n.º 5449758A . Patentes de Google . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  10. ^ Cheng, Tianlu. "Kit de marcadores de peso molecular de proteínas de autodesarrollo y ponderación regular y método para su preparación". Patente de EE. UU. n.º 20130217133A1 . Patentes de Google . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  11. ^ "Marcador de peso molecular de proteína preteñida". Termocientífico . Consultado el 12 de noviembre de 2013 .
  12. ^ abcdef Ingelman, Margareta (2004). "Separación y análisis de proteínas". KE7001 Laboratorios de Bioquímica . Consultado el 12 de noviembre de 2013 .
  13. ^ "Marcadores de peso molecular de proteínas". Ayuda a la biotecnología . 2011 . Consultado el 12 de noviembre de 2013 .
  14. ^ abcdefgh "Guía de selección y comparación de marcadores de peso molecular de proteínas" . Consultado el 16 de noviembre de 2013 .
  15. ^ ab "Marcador de peso molecular biotinilado" . Consultado el 16 de noviembre de 2013 .
  16. ^ ab "Marcadores de peso molecular" . Consultado el 16 de noviembre de 2013 .
  17. ^ ab "Marcador de peso molecular de proteína preteñido Pierce" . Consultado el 16 de noviembre de 2013 .
  18. ^ abcdefghijklmn "Electroforesis: una guía para la electroforesis y detección en gel de poliacrilamida" (PDF) . Bio-Rad .
  19. ^ "Guía de selección y comparación de marcadores de peso molecular de proteínas". Termocientífico . Consultado el 12 de noviembre de 2013 .
  20. ^ abcdefghi "Manual de proteínas 2013" (PDF) . Tecnologías de la vida .
  21. ^ ab Kool, Eric T. "Vectores de ADN circulares para la síntesis de ARN y ADN". Patente estadounidense n.º 6096880A . Patentes de Google . Consultado el 27 de noviembre de 2013 .
  22. ^ Lonza. "Marcadores de ARN de 0,5 a 9 kpb" (PDF) . Documento #18123-0807-06 . Lonza Rockland Inc. Consultado el 27 de noviembre de 2013 .
  23. ^ Biolabs de Nueva Inglaterra. "Marcador de microARN". Bioloabs de Nueva Inglaterra . Consultado el 27 de noviembre de 2013 .
  24. ^ Mechas, Richard J. (1986). "Determinación del peso molecular del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa utilizando formaldehído como desnaturalizante: comparación de marcadores de peso molecular de ARN y ADN". Revista Internacional de Bioquímica . 18 (3): 277–278. doi :10.1016/0020-711x(86)90118-7. PMID  2937672.
  25. ^ ab "N.º de catálogo: R0004". Marcador de ARN Alto Fácil . Abnova . Consultado el 14 de diciembre de 2013 .
  26. ^ "Electroforesis de ARN: Introducción". Electroforesis de ARN . Termo Fisher Scientific Inc. Consultado el 14 de diciembre de 2013 .
  27. ^ "Determinación del peso molecular de proteínas" (PDF) . Consultado el 14 de diciembre de 2013 .
  28. ^ abcdefgh Schlotterer, cristiano. "La evolución de los marcadores moleculares" (PDF) . Consultado el 26 de noviembre de 2013 .
  29. ^ "Mejora de la población" . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  30. ^ Higgins, L. (abril de 2012). "Escalera de ADN para electroforesis en gel". Universidad Lewis y Clark . Consultado el 15 de noviembre de 2013 .
  31. ^ ab Mueller, Ulrich (1999). "Genotipado y toma de huellas dactilares de AFLP" (PDF) . Tendencias en ecología y evolución . 14 (10): 389–394. doi :10.1016/s0169-5347(99)01659-6. PMID  10481200 . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  32. ^ Corporación Invitrogen (2003). "Escalera de ADN AFLP® de 30-330 pb" (PDF) . Manual . Corporación de Tecnologías de Vida . Consultado el 15 de noviembre de 2013 .
  33. ^ Gianniny, Christine; et al. (mayo de 2004). "Análisis unRAPD de ADNmt de flores de tomate libres de artefactos de ADN nuclear" (PDF) . BioTécnicas . 36 (5): 772–776. doi : 10.2144/04365BM04 . PMID  15152595 . Consultado el 15 de noviembre de 2013 .
  34. ^ Roberts, MA; Crawford, DL (1 de junio de 2000). "Uso de ADN polimórfico amplificado aleatoriamente como medio para desarrollar sondas de ADN de Streptomyces específicas de género y cepa". Microbiología Aplicada y Ambiental . 66 (6): 2555–2564. doi :10.1128/AEM.66.6.2555-2564.2000. PMC 110581 . PMID  10831438. 
  35. ^ McClean, Phillip. "Las clases de marcadores moleculares" . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  36. ^ abcdefgh Kosik, Ondrej; Bromley, Jennifer R.; Busse-Wicher, Marta; Zhang, Zhinong; Dupree, Paul (2012). Estudios de escisión enzimática de celulosa mediante análisis de polisacáridos mediante electroforesis en gel de carbohidratos (PACE) . Métodos en enzimología. vol. 510, págs. 51–67. doi :10.1016/B978-0-12-415931-0.00004-5. ISBN 9780124159310. ISSN  0076-6879. PMID  22608721.
  37. ^ Cammack R, Attwood TK, Campbell PN, Parish HJ, Smith A, Stirling JL, Vella F (2006). "Fluoróforo". Diccionario Oxford de Bioquímica y Biología Molecular (Segunda ed.). Prensa de la Universidad de Oxford.