La electroforesis en gel de ácidos nucleicos es una técnica analítica para separar fragmentos de ADN o ARN por tamaño y reactividad. Las moléculas de ácido nucleico se colocan en un gel , donde un campo eléctrico induce a los ácidos nucleicos (que están cargados negativamente debido a su estructura de azúcar- fosfato ) a migrar hacia el ánodo cargado positivamente . Las moléculas se separan a medida que viajan a través del gel en función del tamaño y la forma de cada molécula. Las moléculas más largas se mueven más lentamente porque el gel resiste su movimiento con más fuerza que las moléculas más cortas. Después de un tiempo, se corta la electricidad y se analizan las posiciones de las diferentes moléculas.
El ácido nucleico que se va a separar se puede preparar de varias maneras antes de la separación por electroforesis. En el caso de moléculas de ADN grandes, el ADN se corta con frecuencia en fragmentos más pequeños utilizando una endonucleasa de restricción de ADN (o enzima de restricción). En otros casos, como las muestras amplificadas por PCR , las enzimas presentes en la muestra que podrían afectar la separación de las moléculas se eliminan a través de varios medios antes del análisis. Una vez que el ácido nucleico está preparado adecuadamente, las muestras de la solución de ácido nucleico se colocan en los pocillos del gel y se aplica un voltaje a través del gel durante un período de tiempo específico.
Los fragmentos de ADN de diferentes longitudes se visualizan utilizando un colorante fluorescente específico para el ADN, como el bromuro de etidio . El gel muestra bandas correspondientes a diferentes poblaciones de moléculas de ácido nucleico con diferente peso molecular. El tamaño de los fragmentos se expresa normalmente en "nucleótidos", "pares de bases" o "kb" (para miles de pares de bases), dependiendo de si se ha separado un ácido nucleico monocatenario o bicatenario. La determinación del tamaño de los fragmentos se realiza normalmente mediante comparación con marcadores de ADN disponibles comercialmente que contienen fragmentos de ADN lineales de longitud conocida.
Los tipos de gel que se utilizan con más frecuencia para la electroforesis de ácidos nucleicos son la agarosa (para moléculas de ADN relativamente largas) y la poliacrilamida (para una alta resolución de moléculas de ADN cortas, por ejemplo, en la secuenciación de ADN ). Los geles se han utilizado tradicionalmente en un formato de "losa" como el que se muestra en la figura, pero la electroforesis capilar se ha vuelto importante para aplicaciones como la secuenciación de ADN de alto rendimiento. Las técnicas de electroforesis utilizadas para evaluar el daño del ADN incluyen la electroforesis en gel alcalino y la electroforesis en gel de campo pulsado .
En el caso de segmentos de ADN cortos, como el ADN bicatenario de 20 a 60 pb, su análisis en gel de poliacrilamida (PAGE) proporcionará una mejor resolución (condición nativa). [1] De manera similar, el ARN y el ADN monocatenario se pueden analizar y visualizar mediante geles PAGE que contienen agentes desnaturalizantes como la urea. Los geles PAGE se utilizan ampliamente en técnicas como la impresión de ADN, EMSA y otras técnicas de interacción ADN-proteína.
La medición y el análisis se realizan principalmente con un software de análisis de gel especializado. Los resultados de la electroforesis capilar se muestran normalmente en una vista de trazas denominada electroferograma .
Varios factores pueden afectar la migración de ácidos nucleicos: la dimensión de los poros del gel, el voltaje utilizado, la fuerza iónica del tampón y la concentración del colorante intercalante , como el bromuro de etidio, si se utiliza durante la electroforesis. [2]
El gel tamiza el ADN según el tamaño de la molécula de ADN, por lo que las moléculas más pequeñas viajan más rápido. El ADN bicatenario se mueve a una velocidad que es aproximadamente inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases. Sin embargo, esta relación se rompe con fragmentos de ADN muy grandes y no es posible separarlos utilizando la electroforesis en gel de agarosa estándar . El límite de resolución depende de la composición del gel y la intensidad del campo. [3] y la movilidad del ADN circular más grande puede verse más fuertemente afectada que la del ADN lineal por el tamaño de poro del gel. [4] La separación de fragmentos de ADN muy grandes requiere electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). En la electroforesis en gel de inversión de campo (FIGE, un tipo de PFGE), es posible tener "inversión de banda", donde las moléculas grandes pueden moverse más rápido que las moléculas pequeñas.
La conformación de la molécula de ADN puede afectar significativamente el movimiento del ADN, por ejemplo, el ADN superenrollado generalmente se mueve más rápido que el ADN relajado porque está fuertemente enrollado y, por lo tanto, es más compacto. En una preparación de ADN plasmídico normal, pueden estar presentes múltiples formas de ADN, [5] y el gel de la electroforesis de los plásmidos normalmente mostraría una banda principal que sería la forma superenrollada negativamente, mientras que otras formas de ADN pueden aparecer como bandas menores más tenues. Estas bandas menores pueden ser ADN mellado (forma circular abierta) y la forma circular cerrada relajada que normalmente se mueve más lentamente que el ADN superenrollado , y la forma monocatenaria (que a veces puede aparecer dependiendo de los métodos de preparación) puede moverse por delante del ADN superenrollado. Sin embargo, la velocidad a la que se mueven las diversas formas puede cambiar utilizando diferentes condiciones de electroforesis, por ejemplo, el ADN lineal puede moverse más rápido o más lento que el ADN superenrollado dependiendo de las condiciones, [6] y la movilidad del ADN circular más grande puede verse más fuertemente afectada que el ADN lineal por el tamaño de poro del gel. [4] A menos que se utilicen marcadores de ADN superenrollado , el tamaño de un plásmido circular tipo ADN se puede medir con mayor precisión después de haber sido linealizado por digestión de restricción .
El daño del ADN debido al aumento de la reticulación también reducirá la migración electroforética del ADN de una manera dependiente de la dosis. [7] [8]
El ADN circular se ve más fuertemente afectado por la concentración de bromuro de etidio que el ADN lineal si el bromuro de etidio está presente en el gel durante la electroforesis. Todos los círculos de ADN que se producen de forma natural están subenrollados, pero el bromuro de etidio que se intercala en el ADN circular puede cambiar la carga, la longitud y la superhelicidad de la molécula de ADN, por lo tanto, su presencia durante la electroforesis puede afectar su movimiento en el gel. El aumento de bromuro de etidio intercalado en el ADN puede cambiarlo de una molécula superenrollada negativamente a una forma completamente relajada, y luego a una superhélice enrollada positivamente en la intercalación máxima. [9] La electroforesis en gel de agarosa se puede utilizar para resolver el ADN circular con diferente topología de superenrollamiento.
La concentración del gel determina el tamaño de poro del gel, lo que afecta la migración del ADN. La resolución del ADN cambia con la concentración porcentual del gel. Aumentar la concentración de agarosa de un gel reduce la velocidad de migración y mejora la separación de moléculas de ADN más pequeñas, mientras que reducir la concentración del gel permite separar moléculas de ADN grandes. Para una electroforesis en gel de agarosa estándar, una concentración de gel del 0,7 % proporciona una buena separación o resolución de fragmentos de ADN grandes de 5 a 10 kb, mientras que una concentración de gel del 2 % proporciona una buena resolución para fragmentos pequeños de 0,2 a 1 kb. Se puede utilizar una concentración de gel de hasta el 3 % para separar fragmentos muy pequeños, pero un gel de poliacrilamida vertical sería más apropiado para resolver fragmentos pequeños. Sin embargo, los geles de alta concentración requieren tiempos de ejecución más prolongados (a veces días) y los geles de alto porcentaje suelen ser frágiles y pueden no fraguar de manera uniforme. Los geles de agarosa de alto porcentaje deben ejecutarse con PFGE o FIGE. Los geles de bajo porcentaje (0,1-0,2 %) son frágiles y pueden romperse. Los geles al 1% son comunes para muchas aplicaciones. [10]
A voltajes bajos, la velocidad de migración del ADN es proporcional al voltaje aplicado, es decir, cuanto mayor sea el voltaje, más rápido se mueve el ADN. Sin embargo, al aumentar la intensidad del campo eléctrico, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular aumenta de manera diferencial, y el rango efectivo de separación disminuye y, por lo tanto, la resolución es menor a alto voltaje. Para una resolución óptima del ADN de más de 2 kb de tamaño en la electroforesis en gel estándar, se recomienda de 5 a 8 V/cm. [6] El voltaje también está limitado por el hecho de que calienta el gel y puede hacer que el gel se derrita si se hace funcionar un gel a alto voltaje durante un período prolongado, en particular para el gel de agarosa de bajo punto de fusión.
Sin embargo, la movilidad del ADN puede cambiar en un campo inestable. En un campo que se invierte periódicamente, la movilidad del ADN de un tamaño particular puede disminuir significativamente a una frecuencia de ciclo particular. [11] Este fenómeno puede dar lugar a una inversión de bandas, por la que los fragmentos de ADN más grandes se mueven más rápido que los más pequeños en PFGE.
La carga negativa de su cadena principal de fosfato mueve el ADN hacia el ánodo cargado positivamente durante la electroforesis. Sin embargo, la migración de moléculas de ADN en solución, en ausencia de una matriz de gel, es independiente del peso molecular durante la electroforesis, es decir, no hay separación por tamaño sin una matriz de gel. [12] La interacción hidrodinámica entre diferentes partes del ADN se interrumpe por el flujo de contraiones que se mueven en la dirección opuesta, por lo que no existe ningún mecanismo para generar una dependencia de la velocidad con respecto a la longitud en una escala mayor que la longitud de cribado de aproximadamente 10 nm. [11] Esto lo hace diferente de otros procesos como la sedimentación o la difusión, donde la interacción hidrodinámica de largo alcance es importante.
Por lo tanto, la matriz de gel es responsable de la separación del ADN por tamaño durante la electroforesis, sin embargo, el mecanismo preciso responsable de la separación no está completamente claro. Existe una serie de modelos para el mecanismo de separación de biomoléculas en la matriz de gel, uno ampliamente aceptado es el modelo de Ogston que trata la matriz de polímero como un tamiz que consiste en una red distribuida aleatoriamente de poros interconectados. [13] Una proteína globular o un ADN en espiral aleatoria se mueve a través de los poros conectados lo suficientemente grandes como para permitir su paso, y el movimiento de moléculas más grandes es más probable que se vea impedido y ralentizado por colisiones con la matriz de gel, y las moléculas de diferentes tamaños pueden, por lo tanto, separarse en este proceso de tamizado. [11]
Sin embargo, el modelo de Ogston no es válido para moléculas grandes, en las que los poros son significativamente más pequeños que el tamaño de la molécula. Para moléculas de ADN de tamaño superior a 1 kb, se utiliza con más frecuencia un modelo de reptación (o sus variantes). Este modelo supone que el ADN puede arrastrarse como una serpiente (de ahí la palabra "reptación") a través de los poros como una molécula alargada. Con una intensidad de campo eléctrico mayor, esto se convierte en un modelo de reptación sesgado, en el que el extremo delantero de la molécula se sesga fuertemente en la dirección hacia delante, y este borde delantero tira del resto de la molécula. En el modo totalmente sesgado, la movilidad alcanza un punto de saturación y el ADN que supera un cierto tamaño no se puede separar. [13] Sin embargo, en la práctica no se observa una alineación paralela perfecta de la cadena con el campo, ya que eso significaría la misma movilidad para moléculas largas y cortas. [11] Un mayor refinamiento del modelo de reptación sesgado tiene en cuenta las fluctuaciones internas de la cadena. [14]
El modelo de reptación sesgada también se ha utilizado para explicar la movilidad del ADN en PFGE. La orientación del ADN se construye progresivamente por reptación después del inicio de un campo, y el tiempo en que alcanza la velocidad de estado estable depende del tamaño de la molécula. Cuando se cambia el campo, las moléculas más grandes tardan más en reorientarse, por lo que es posible discriminar entre las cadenas largas que no pueden alcanzar su velocidad de estado estable de las cortas que viajan la mayor parte del tiempo a velocidad constante. [14] Sin embargo, también existen otros modelos.
La microscopía de fluorescencia en tiempo real de las moléculas teñidas mostró una dinámica más sutil durante la electroforesis, con el ADN mostrando una elasticidad considerable a medida que se estira alternativamente en la dirección del campo aplicado y luego se contrae en una bola, o se engancha en una forma de U cuando queda atrapado en las fibras de polímero. [15] [16] Esta observación puede denominarse el modelo de "oruga". [17] Otro modelo propone que el ADN se enreda con la matriz de polímero, y cuanto más grande es la molécula, más probabilidades hay de que se enrede y su movimiento se vea impedido. [18]
El colorante más común utilizado para hacer visibles las bandas de ADN o ARN en la electroforesis en gel de agarosa es el bromuro de etidio , abreviado habitualmente como EtBr. Fluoresce bajo luz ultravioleta cuando se intercala en el surco mayor del ADN (o ARN). Al pasar el ADN por un gel tratado con EtBr y visualizarlo con luz ultravioleta, cualquier banda que contenga más de ~20 ng de ADN se vuelve claramente visible. El EtBr es un mutágeno conocido [19] y existen alternativas más seguras, como GelRed , producido por Biotium, que se une al surco menor [20] .
SYBR Green I es otra tinción de dsADN, producida por Invitrogen . Es más cara, pero 25 veces más sensible y posiblemente más segura que EtBr, aunque no hay datos que aborden su mutagenicidad o toxicidad en humanos. [21]
SYBR Safe es una variante de SYBR Green que ha demostrado tener niveles de mutagenicidad y toxicidad lo suficientemente bajos como para ser considerado un residuo no peligroso según las regulaciones federales de los EE. UU. [22] Tiene niveles de sensibilidad similares al EtBr, [22] pero, al igual que SYBR Green, es significativamente más caro. Sin embargo, en países donde la eliminación segura de residuos peligrosos es obligatoria, los costos de la eliminación del EtBr pueden superar fácilmente la diferencia de precio inicial.
Como el ADN teñido con EtBr no es visible a la luz natural, los científicos mezclan el ADN con tampones de carga con carga negativa antes de añadir la mezcla al gel. Los tampones de carga son útiles porque son visibles a la luz natural (a diferencia de la luz ultravioleta para el ADN teñido con EtBr) y se co-sedimentan con el ADN (lo que significa que se mueven a la misma velocidad que el ADN de una determinada longitud). El xileno cianol y el azul de bromofenol son colorantes comunes que se encuentran en los tampones de carga; se mueven aproximadamente a la misma velocidad que los fragmentos de ADN de 5000 pb y 300 pb de longitud respectivamente, pero la posición precisa varía con el porcentaje del gel. Otros marcadores de progreso utilizados con menos frecuencia son el rojo de cresol y el naranja G , que se mueven a unos 125 pb y 50 pb, respectivamente.
La visualización también se puede lograr transfiriendo ADN después de la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS a una membrana de nitrocelulosa y luego exponiéndolo a una sonda de hibridación . Este proceso se denomina Southern blotting .
En el caso de los colorantes fluorescentes, después de la electroforesis, el gel se ilumina con una lámpara ultravioleta (normalmente colocándolo sobre una caja de luz, mientras se utiliza equipo de protección para limitar la exposición a la radiación ultravioleta). El aparato iluminador también suele contener un aparato de formación de imágenes que toma una imagen del gel, tras la iluminación con radiación ultravioleta. El bromuro de etidio emite una fluorescencia de color naranja rojizo en presencia de ADN, ya que se ha intercalado con él. La banda de ADN también se puede cortar del gel y luego se puede disolver para recuperar el ADN purificado. A continuación, el gel se puede fotografiar, normalmente, con una cámara digital o polaroid. Aunque el ácido nucleico teñido emite una fluorescencia de color naranja rojizo, las imágenes suelen mostrarse en blanco y negro (véanse las figuras). El daño causado por los rayos UV a la muestra de ADN puede reducir la eficacia de la manipulación posterior de la muestra, como la ligadura y la clonación. Las radiaciones UV de longitud de onda más corta (302 o 312 nm) causan un daño mayor; por ejemplo, la exposición durante tan solo 45 segundos puede reducir significativamente la eficacia de la transformación . Por lo tanto, si el ADN se va a utilizar para procedimientos posteriores, la exposición a radiaciones UV de longitud de onda más corta debe limitarse, en su lugar se debe utilizar radiación UV de longitud de onda más alta (365 nm) que causa menos daño. Sin embargo, las radiaciones de longitud de onda más alta producen una fluorescencia más débil, por lo tanto, si es necesario capturar la imagen del gel, se puede utilizar una luz UV de longitud de onda más corta durante un corto tiempo. La adición de citidina o guanosina al tampón de electroforesis a una concentración de 1 mM puede proteger el ADN del daño. [23] Alternativamente, se puede utilizar una fuente de excitación de luz azul con un tinte excitable por azul como SYBR Green o GelGreen .
La investigación mediante electroforesis en gel a menudo aprovecha herramientas de análisis de imágenes basadas en software, como ImageJ .