stringtranslate.com

Marcador de tamaño de peso molecular

Marcador de tamaño de peso molecular en forma de escalera de ADN de 1 kb en el carril más a la derecha, utilizado en electroforesis en gel. Las condiciones del gel son agarosa al 1 %, 3 voltios /cm y tinción con bromuro de etidio .

Un marcador de tamaño de peso molecular , también conocido como escalera de proteínas , escalera de ADN o escalera de ARN , es un conjunto de estándares que se utilizan para identificar el tamaño aproximado de una molécula que se procesa en un gel durante la electroforesis , utilizando el principio de que el peso molecular es inversamente proporcional a la velocidad de migración a través de una matriz de gel. Por lo tanto, cuando se utilizan en la electroforesis en gel , los marcadores proporcionan efectivamente una escala logarítmica con la que estimar el tamaño de los otros fragmentos (siempre que se conozcan los tamaños de los fragmentos del marcador).

Los marcadores de proteínas, ADN y ARN con tamaños y concentraciones de fragmentos predeterminados están disponibles comercialmente. Estos se pueden analizar en geles de agarosa o poliacrilamida . Los marcadores se cargan en carriles adyacentes a los carriles de muestra antes del comienzo del análisis.

Marcadores de ADN

Gel electroforético con escaleras de ADN de longitudes variables en el carril izquierdo y el carril central. Los tamaños de los fragmentos están marcados a la derecha, en pares de bases .

Desarrollo

Aunque se ha mantenido el concepto de marcadores de peso molecular, las técnicas de desarrollo han variado a lo largo de los años. Las nuevas invenciones de marcadores de peso molecular se distribuyen en kits específicos para el tipo de marcador.

Un problema inicial en el desarrollo de marcadores fue lograr una alta resolución en toda la longitud del marcador. [1] Dependiendo de las condiciones de funcionamiento de la electroforesis en gel, los fragmentos pueden haberse comprimido, lo que altera la claridad. Para abordar este problema, en 1990 se desarrolló un kit para el análisis Southern Blot , que proporcionó el primer marcador que combinaba ADN objetivo y ADN sonda. Esta técnica aprovechó el espaciado logarítmico y se podía utilizar para identificar bandas objetivo con una longitud de 20 000 nucleótidos . [2]

Diseño

Existen dos métodos comunes para construir un marcador de tamaño de peso molecular de ADN. [3] Uno de estos métodos emplea la técnica de ligadura parcial . [3] La ligadura de ADN es el proceso por el cual las piezas de ADN lineal se conectan entre sí a través de enlaces covalentes ; más específicamente, estos enlaces son enlaces fosfodiéster . [4] Aquí, una pieza de ADN dúplex de 100 pb se liga parcialmente. La consecuencia de esto es que se formarán dímeros de 200 pb, trímeros de 300 pb, tetrámeros de 400 pb, pentámeros de 500 pb, etc. Además, permanecerá una porción del dsADN de 100 pb. Como resultado, se crea una "escalera" de ADN compuesta por piezas de ADN de masa molecular conocida en el gel. [3]

El segundo método emplea enzimas de restricción y una secuencia de ADN reconocida. [3] El ADN es digerido por una enzima de restricción particular, lo que da como resultado fragmentos de ADN de diferentes masas moleculares. Una de las ventajas de este método es que se puede crear más marcador fácilmente simplemente digiriendo más ADN conocido. [3] Por otro lado, el tamaño de los fragmentos de ADN se basa en los sitios donde corta la enzima de restricción. Esto hace que sea más difícil controlar el tamaño de los fragmentos en el marcador. [5]

Más recientemente, los laboratorios están empleando otro método para construir marcadores de tamaño de peso molecular de ADN. Esta estrategia implica el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . [5] Esto se logra de una o dos maneras: 1) se amplifica un objetivo de ADN al mismo tiempo mediante conjuntos de cebadores , o 2) se amplifican diferentes objetivos de ADN de forma independiente mediante cebadores particulares. [5]

Efectos de las condiciones de gel

Al igual que con las muestras experimentales, las condiciones del gel pueden afectar el tamaño del marcador de peso molecular que corre junto a ellas. Factores como el tampón , la carga/ voltaje y la concentración del gel pueden afectar la movilidad o la apariencia del marcador/escalera/estándar. Estos elementos deben tenerse en cuenta al seleccionar un marcador y al analizar los resultados finales en un gel.

Gel de agarosa al 1,2 % que muestra dos escaleras de ADN diferentes teñidas con el tinte GelRed
Buffers
Los tampones actúan para 1) establecer el pH y 2) proporcionar iones para mantener la conductividad. En la electroforesis de ADN , el TAE (Tris-acetato-EDTA) y el TBE (Tris-borato-EDTA) son los tampones de elección habituales. [6] El tampón TBE se prefiere para fragmentos pequeños de ADN, mientras que el TAE es más adecuado para fragmentos mayores de 1500 pares de bases. En términos de capacidad de amortiguación, el TAE es menor en comparación con el TBE; esto generalmente da como resultado una movilidad más lenta del ADN. El TBE también es capaz de lograr una mejor resolución. [7]
Se debe tener en cuenta que el agua no puede actuar como sustituto de uno de estos tampones, ya que el ADN no migrará a lo largo del gel. [6] Además, el uso de agua en lugar de tampón provocará la fusión del gel . [8]
Carga/voltaje
En términos de voltaje, el rango recomendado es entre 4 y 10 V/cm (es decir, voltios/cm). [8] Los geles de agarosa generalmente se hacen funcionar a un voltaje de 5 V/cm. [3] [6] La unidad de distancia, cm , se refiere a la distancia entre los electrodos (es decir, el ánodo y el cátodo ) y no a la longitud del gel en sí. [3] [6]
Los voltajes demasiado por debajo o por encima de este rango afectarán la movilidad y la resolución de las bandas. Los voltajes bajos disminuirán la movilidad y harán que las bandas se ensanchen. Por otro lado, los voltajes altos disminuirán la resolución de las bandas. Esto se debe en gran medida al hecho de que los voltajes demasiado altos pueden hacer que el gel se sobrecaliente e incluso se derrita. [8]
Concentración
La concentración de agarosa debe tenerse en cuenta al seleccionar un marcador. El porcentaje de gel afecta la migración del ADN. [3] [6] Generalmente, cuanto mayor sea la concentración de gel, más lenta será la velocidad a la que el ADN se moverá a través del gel. Esto se suma al papel que desempeña el peso molecular en la migración de un marcador o muestra de ADN, es decir, cuanto mayor sea el peso molecular, más lenta será la migración del ADN. [3] [6]
La concentración del gel también afecta la capacidad de visualizar las bandas que se extienden sobre el gel. Las bandas más pequeñas se resuelven mejor en un gel con un porcentaje más alto, mientras que las bandas de mayor peso molecular se visualizan más fácilmente en un gel con un porcentaje más bajo. [6]

Marcadores de proteínas

Desarrollo

Anteriormente, se habían desarrollado marcadores proteicos utilizando una variedad de proteínas completas. El desarrollo de un kit que incluía un marcador de tamaño de peso molecular basado en fragmentos de proteínas comenzó en 1993. Este marcador proteico, compuesto por 49 secuencias de aminoácidos diferentes , incluía proteínas multidominio y permitía el análisis de proteínas escindidas en diferentes sitios. [9]

Las mejoras técnicas actuales en los marcadores proteicos implican el uso del desarrollo automático. El primer marcador proteico de peso regular desarrollado automáticamente se inventó en 2012. [10]

Diseño

Al igual que los marcadores de ADN, estos marcadores suelen estar compuestos de proteínas purificadas cuyas masas moleculares ya se conocen. [3] La siguiente lista describe algunas de las proteínas, así como la masa molecular, que se utilizan comúnmente al construir un marcador de proteína.

Inmunotransferencia con escalera de proteínas en el carril más a la izquierda. Los tamaños de los fragmentos se miden en kDa ( kilodaltons ).

Cómo elegir el marcador proteico adecuado

Los marcadores de tamaño de peso molecular se pueden dividir en dos categorías: marcadores de peso molecular frente a marcadores de escalera molecular. [14] Los marcadores están teñidos o no teñidos y, según las circunstancias, uno puede ser más apropiado que otro. Los marcadores de tamaño de peso molecular también se pueden alterar bioquímicamente. [15] La conjugación con biotina es la más común. Los marcadores de tamaño de peso molecular se utilizan con mayor frecuencia en la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y en la transferencia Western . Con todos los diferentes tipos y usos de los marcadores de tamaño de peso molecular, es importante elegir el estándar de proteína adecuado. Además del uso más común, como una forma de calcular el peso molecular de las muestras, otros usos incluyen permitir la evidencia visual de la migración de proteínas y la eficiencia de transferencia y, a veces, incluso se utilizan para el control positivo. [16]

Marcador de peso molecular frente a escalera de proteínas
Un marcador de peso molecular es un tipo de proteína estándar. Pueden estar teñidos previamente o no teñidos antes de la carga; dependiendo del tipo de experimento, uno puede ser más ventajoso. En cualquier caso, normalmente se ejecutan en el carril exterior de un gel, mientras que la muestra se carga en los carriles centrales. [14] Los marcadores moleculares se diferencian de las escaleras de proteínas en que están compuestos por una mezcla de proteínas nativas cuyas especificaciones están bien categorizadas pero no corresponden a números enteros. [14] Generalmente, estos son mucho más baratos, pero el análisis solo permite un valor aproximado de las proteínas separadas por electroforesis. [14]
Una escalera de proteínas es otro tipo de estándar de proteínas. Casi siempre están teñidas. [14] Las escaleras de proteínas se diferencian de los marcadores moleculares en que están compuestas por una mezcla de proteínas altamente purificadas cuyas especificaciones son conocidas y corresponden a números enteros. [14] Generalmente, las escaleras de proteínas están compuestas por 10-12 proteínas. [14] Al final del experimento, después de que se produce la migración de tamaño, una sola banda representará el tamaño de cada proteína contenida en la escalera. [17] Los marcadores están espaciados uniformemente, y el análisis de tamaño utilizando estos marcadores permite un valor preciso de la proteína de interés. En algunos casos, como método de confirmación molecular, los marcadores de peso molecular se ejecutan con escaleras de proteínas para verificación. [14]
Marcadores pre-teñidos y sin teñir
Los marcadores de proteínas pueden venir sin teñir o preteñidos, pero ambos tienen sus ventajas y desventajas. [18] La visualización simple de la separación y transferencia de proteínas es posible mediante el uso de marcadores preteñidos. [18] Se utilizan comúnmente tanto en la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS como en la inmunotransferencia. En la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, permite el seguimiento de la migración de proteínas, ya que las bandas de proteínas se separarán y se podrán ver durante una ejecución electroforética. En las inmunotransferencias Western, los estándares de proteínas teñidas permiten la visualización de la transferencia de proteínas a la membrana. [17] Sin embargo, las determinaciones de tamaño no son tan precisas con estos marcadores (consulte la sección Marcadores recombinantes y naturales para obtener más explicaciones). [18]
Si bien los marcadores sin teñir permiten determinar el tamaño con mayor precisión, no se pueden ver mientras el gel está en funcionamiento. Por lo tanto, el gel debe teñirse para poder visualizar las bandas. [19]
Marcadores recombinantes y naturales
Además de los marcadores teñidos y no teñidos, los marcadores proteicos pueden considerarse recombinantes y naturales. [18] Los marcadores recombinantes consisten en proteínas recombinantes que han sido muy purificadas. Estos marcadores están diseñados de tal manera que resaltan características particulares. [18] Los ejemplos de estas características incluyen etiquetas de afinidad y pesos moleculares que están ubicados uniformemente entre sí. [18]
Los marcadores naturales, como su nombre lo indica, son una mezcla de proteínas que se producen de forma natural. [18] Los marcadores naturales preteñidos funcionan bien para la visualización de la separación en gel. Sin embargo, estos marcadores tienden a unirse a la tinción de forma covalente en cantidades variables y en varias posiciones. [18] En consecuencia, las bandas resultantes pueden ser más anchas. Esto es especialmente cierto cuando se hacen comparaciones con marcadores recombinantes preteñidos. Debido a este efecto, es probable que las determinaciones del peso molecular sean menos precisas con los marcadores naturales preteñidos. [18]
Alterado bioquímicamente
Los estándares de proteínas también pueden alterarse químicamente. Una alteración común es mediante el uso de biotina . La biotina tiene una afinidad muy alta por la estreptavidina y, por lo tanto, la unión forma un complejo muy fuerte. Para la visualización, se coloca una etiqueta de color en la estreptavidina. [15]

Efectos de las condiciones de gel

Al igual que con la electroforesis de ADN, al seleccionar un marcador de proteína se deben tener en cuenta condiciones como los tampones, la carga/voltaje y la concentración.

Buffers
Los tampones pueden afectar la movilidad tanto del marcador como de las muestras. El pH del tampón varía con el sistema utilizado y, en consecuencia, cada sistema de tampón tendrá un efecto diferente en la carga de una proteína o proteínas. [20] Además, en el caso de SDS-PAGE, la afinidad de unión para SDS puede verse afectada por el sistema de tampón. [20] Incluso cuando se utiliza el mismo porcentaje y tipo de gel, las mismas proteínas migrarán a diferentes velocidades según el tampón utilizado. [20]
Carga/voltaje
El voltaje juega un papel en la movilidad de las proteínas en un gel. Las proteínas migrarán más rápido a voltajes más altos. En consecuencia, el tiempo de funcionamiento del gel será más corto. Por el contrario, voltajes más altos pueden resultar en una mayor difusión de banda. [20] Además, si el voltaje es demasiado alto, la temperatura en la cámara de electroforesis puede llegar a ser tal que el gel comience a derretirse. [20]
El voltaje al que se debe hacer funcionar un gel depende del tipo de gel. En algunos geles, el voltaje permanece constante durante todo el proceso, mientras que en otros, el voltaje inicial se deja constante durante un tiempo específico antes de aumentarlo. [20] Luego, este segundo voltaje se utiliza durante un período de tiempo específico, después del cual también se puede aumentar. [20]
Concentración
En términos de porcentaje, los geles utilizados para la electroforesis de proteínas se pueden dividir en geles de porcentaje único y geles de gradiente. [18] Los geles de porcentaje único también se conocen como geles lineales. [20] Para los geles lineales, el porcentaje seleccionado generalmente cae entre 7.5% y 20%. [18] Los rangos de porcentaje comunes para geles de gradiente son 4-15% y 10-20%. Cada tipo de gel tiene sus propias ventajas. [18] Por ejemplo, los geles lineales se prefieren cuando varias proteínas tienen pesos moleculares similares; una mejor separación entre estas proteínas se mostrará mediante un gel lineal. [18] Por otro lado, los geles de gradiente son una mejor opción cuando las muestras de interés contienen proteínas de pesos moleculares muy diferentes o que cubren un amplio rango de pesos moleculares. [18] [20]

Marcadores de ARN

Carril de gel de agarosa sometido a electroforesis que muestra una escalera de ARN con bandas en un rango de 281 a 6583 pares de bases

Desarrollo

Las escaleras de ARN compuestas de marcadores de tamaño de peso molecular de ARN se desarrollaron inicialmente utilizando el método del círculo sintético [21] para producir marcadores de diferentes tamaños. Esta técnica fue mejorada por el inventor Eric T. Kool para utilizar vectores de ADN circulares como un método para producir marcadores de tamaño de peso molecular de ARN. Conocido como el método del círculo rodante, las mejoras de esta técnica se derivan de su eficiencia en la síntesis de oligonucleótidos de ARN . A partir de la plantilla de ADN circular, se puede producir ARN monocatenario que varía en longitud de 4-1500 pb sin la necesidad de cebadores y reciclando el trifosfato de nucleótidos . El ADN también se puede sintetizar a partir de la plantilla circular, lo que aumenta la versatilidad de esta técnica. En comparación con la transcripción de escorrentía , el método del círculo sintético produce oligonucleótidos de ARN sin la escorrentía. En comparación con la PCR , el método del círculo sintético produce oligonucleótidos de ARN sin la necesidad de polimerasa ni un ciclador térmico . Este método también es rentable en su capacidad de sintetizar grandes cantidades de producto con una tasa de error menor que los sintetizadores de máquina. [21]

Diseño

Los marcadores de ARN consisten en transcripciones de ARN de varias longitudes crecientes. Por ejemplo, el marcador Lonza de 0,5 a 9 kbp [22] tiene bandas que marcan 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6 y 9 pares de kilobases . Los marcadores se disuelven en un tampón de almacenamiento, como EDTA , y pueden tener una vida útil de hasta 2 años cuando se almacenan a -80 °C. Para utilizar el marcador, como para el análisis de transferencia Northern, primero se descongela y luego se tiñe para que sea detectable en una electroforesis en gel. Uno de los colorantes más comunes utilizados para los marcadores es el bromuro de etidio .

El rango de un marcador en particular se refiere a la variedad de bandas que puede mapear. Un rango "alto" se refiere a fragmentos relativamente grandes (medidos en kb) mientras que un rango "bajo" se refiere a marcadores que distinguen entre fragmentos pequeños (medidos en pb). Algunos marcadores pueden incluso describirse como de "rango ultrabajo", [16] pero aún más preciso es el marcador de microARN. Un marcador de microARN se puede utilizar para medir fragmentos de ARN dentro de una docena de nucleótidos, como el marcador de microARN de 17-25 nt. [23]

Usar

En pesos moleculares equivalentes, el ARN migrará más rápido que el ADN. Sin embargo, tanto el ARN como el ADN tienen una pendiente lineal negativa entre su distancia de migración y su peso molecular logarítmico . [24] Es decir, las muestras de menor peso pueden migrar una distancia mayor. Esta relación es un factor a tener en cuenta al elegir marcadores de ARN o ADN como estándar.

Al analizar marcadores de ARN y muestras de ARN en un gel, es importante evitar la contaminación por nucleasas , ya que el ARN es muy sensible a la degradación por ribonucleasas (RNasa) a través de la catálisis . [25] [26] Por lo tanto, se deben tener en cuenta todos los materiales que se utilizarán en el procedimiento. Cualquier material de vidrio que entre en contacto con el ARN debe tratarse previamente con dietilpirocarbonato (DEPC) y los materiales plásticos deben ser desechables. [25]

Marcadores de tamaño de peso molecular y SDS-PAGE

Gel SDS-PAGE que utiliza un estándar de tamaño de peso molecular en el carril exterior izquierdo

Uno de los usos más comunes de los marcadores de tamaño de peso molecular es la electroforesis en gel. El propósito de la electroforesis en gel es separar proteínas por propiedades físicas o químicas , que incluyen carga, tamaño molecular y pH . Cuando se separa en función del tamaño, el método ideal es SDS-PAGE o electroforesis en gel de poliacrilamida y los marcadores de tamaño de peso molecular son los estándares adecuados para usar.

Los geles pueden variar de tamaño. La cantidad de muestras que se van a analizar determinará el tamaño de gel adecuado. Todos los geles se dividen en carriles que recorren el gel en paralelo. Cada carril contendrá una muestra específica. Por lo general, los estándares de tamaño de peso molecular se colocan en un carril exterior. Si un gel tiene una cantidad particularmente alta de carriles, se pueden colocar múltiples escaleras a lo largo del gel para lograr una mayor claridad.

Las proteínas y los estándares se pipetean en el gel en los carriles apropiados. El dodecil sulfato de sodio (SDS) interactúa con las proteínas, las desnaturaliza y les otorga una carga negativa. Dado que todas las proteínas tienen la misma relación carga-masa, la movilidad de las proteínas a través del gel se basará únicamente en el peso molecular. Una vez que se activa el campo eléctrico, se iniciará la migración de proteínas. Una vez completado, se puede utilizar un mecanismo de detección como el Western blotting, que revelará la presencia de bandas. Cada banda representa una proteína específica. La distancia recorrida se basa únicamente en el peso molecular; por lo tanto, el peso molecular de cada proteína se puede determinar comparando la distancia de una proteína desconocida con el estándar de peso molecular conocido. [27]

Diferentes usos de los marcadores de tamaño de peso molecular

Existen muchos tipos de marcadores de tamaño de peso molecular y cada uno posee características únicas que permiten su uso en diversas técnicas biológicas. La selección de un marcador de tamaño de peso molecular depende del tipo de marcador (ADN, ARN o proteína) y del rango de longitud que ofrece (por ejemplo, 1 kb). Antes de seleccionar un marcador de tamaño de peso molecular, es importante familiarizarse con estas características y propiedades. En un caso particular, un tipo puede ser más apropiado que otro. Aunque los marcadores específicos pueden variar entre los protocolos para una técnica determinada, en esta sección se describirán los marcadores generales y sus funciones.

Aloenzimas

El primer tipo de marcador molecular desarrollado y analizado en electroforesis en gel fueron las alozimas . Estos marcadores se utilizan para detectar variaciones en las proteínas. La palabra "alozima" (también conocida como "aloenzima") proviene de " variantes alélicas de las enzimas ". [28] Cuando se analizan en un gel, las proteínas se separan por tamaño y carga. Aunque las alozimas pueden parecer anticuadas en comparación con otros marcadores disponibles, todavía se utilizan hoy en día, principalmente debido a su bajo costo. Una desventaja importante es que, dado que solo hay una cantidad limitada disponible, la especificidad es un problema. [28]

Marcadores basados ​​en ADN (década de 1960)

Aunque las alozimas pueden detectar variaciones en el ADN, lo hacen mediante un método indirecto y no muy preciso. Los marcadores basados ​​en el ADN se desarrollaron en la década de 1960. [28] Estos marcadores son mucho más eficaces para distinguir entre variantes del ADN. Hoy en día, estos son los marcadores más utilizados. Los marcadores basados ​​en el ADN funcionan mediante el estudio de los nucleótidos, lo que puede cumplir una variedad de funciones, como detectar diferencias en los nucleótidos o incluso cuantificar el número de mutaciones . [28]

RFLP
El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción es una técnica utilizada para detectar variaciones en el ADN homólogo . [29] Se utilizan endonucleasas de restricción específicas para digerir el ADN. El marcador molecular RFLP es específico de un único fragmento. Junto con los marcadores RFLP aléicos, también se incluye un marcador de tamaño de peso molecular, en este caso un marcador de ADN, [30] en un gel de agarosa sometido a electroforesis . El marcador de ADN permite estimar el tamaño de los fragmentos de restricción.
Minisatélites
De manera similar al RFLP, esta técnica también utiliza endonucleasas de restricción para digerir el ADN genómico. Los minisatélites son secuencias cortas de repeticiones en tándem, de aproximadamente 10 a 60 pares de bases. Los minisatélites se pueden utilizar en la identificación de huellas de ADN y como reguladores del control genético. [28]

Marcadores basados ​​en PCR (década de 1980)

El éxito de los marcadores basados ​​en ADN condujo al desarrollo de la PCR. La PCR ( reacción en cadena de la polimerasa ) es una técnica de amplificación de ADN que se puede aplicar a varios tipos de fragmentos. Antes de este desarrollo, para amplificar el ADN, este tenía que ser clonado o aislado. Poco después del descubrimiento de la PCR surgió la idea de utilizar marcadores basados ​​en PCR para la electroforesis en gel. Este tipo de marcadores se basan en cebadores de PCR y se clasifican como polimorfismos de secuencia de ADN . [28]

Gel de electroforesis que muestra productos de PCR. El carril más a la izquierda representa una escalera de ADN con fragmentos a intervalos de 100 pb.
Microsatélites
Los microsatélites , también conocidos como SSR ( simple sequence repeats ) o STR ( short tandem repeats ), se diferencian de los minisatélites en que son más cortos, normalmente de 2 a 6 pares de bases. Esta propiedad de los microsatélites permite un fácil aislamiento. Los microsatélites se utilizan con mayor frecuencia en genética de poblaciones . Los microsatélites tienen una tasa de mutación alta y compleja, que es su principal desventaja. [28]
AFLP
El polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados es una técnica de identificación de ADN basada en PCR . El ADN se digiere primero con endonucleasas. Luego, los fragmentos de restricción se ligan entre sí. [31] Luego, se genera un marcador molecular cuando se seleccionan fragmentos específicos para la amplificación . Los marcadores AFLP se ejecutan junto con un marcador de ADN en un gel. Un marcador de ADN AFLP común tiene una longitud de 30 a 330 pb. [32] Los fragmentos de este marcador se encuentran a intervalos de 10 pb para aumentar la precisión.
Policía Regional de Alaska
El ADN polimórfico amplificado al azar es una técnica que se lleva a cabo de manera similar al AFLP. La diferencia es que los marcadores moleculares se generan de manera aleatoria. [31] El marcador de tamaño de peso molecular más común para esta técnica es la escalera de ADN de 1 kb. [33] [34]

Polimorfismo de secuencia de ADN

Aunque técnicamente hablando, el polimorfismo de secuencias de ADN se ha estado produciendo desde el uso de RFLP en la década de 1960, el análisis ha cambiado significativamente con el paso de los años. El polimorfismo de secuencias de ADN utiliza técnicas más antiguas como RFLP, pero a mayor escala. La secuenciación es mucho más rápida y eficiente. El análisis está automatizado, ya que utiliza una técnica conocida como secuenciación shotgun. Este método de alto rendimiento se utiliza comúnmente en genética de poblaciones. [28]

SNP
Los SNP ( polimorfismos de un solo nucleótido ) se utilizan para detectar variaciones en nucleótidos individuales. La técnica es muy similar a la de RFLP. Los SNP se utilizan con frecuencia para estudios genéticos de poblaciones. [35] Después de la amplificación mediante PCR, estos pequeños fragmentos se pueden visualizar mediante electroforesis en gel y, nuevamente, los marcadores de ADN desempeñan un papel en la determinación de la longitud del fragmento.

Análisis de polisacáridos mediante electroforesis en gel de carbohidratos

Los marcadores de carbohidratos se emplean en una técnica conocida como análisis de polisacáridos por electroforesis en gel de carbohidratos (PACE), que es una técnica de separación medible. [36] Permite el análisis de productos de hidrólisis enzimática. [36] Se ha utilizado en aplicaciones como la caracterización de enzimas involucradas en la degradación de hemicelulosa , la determinación de la estructura de polisacáridos de hemicelulosa y el análisis de la escisión enzimática de productos de celulosa . [36]

PACE depende de la derivatización, que es la conversión de un compuesto químico en un derivado . [36] [37] Aquí los monosacáridos , oligosacáridos y polisacáridos son los compuestos de interés. Están marcados en sus extremos reductores con una etiqueta fluorescente (es decir, un fluoróforo ). [36] Esta derivatización con un fluoróforo permite tanto la separación en un gel en las circunstancias deseadas como la obtención de imágenes de fluorescencia del gel. En este caso, se utiliza un gel de poliacrilamida. [36]

Al igual que con la electroforesis de ADN, ARN y proteínas, los marcadores se analizan junto con las muestras de interés en la electroforesis en gel de carbohidratos. [36] Los marcadores consisten en oligosacáridos de peso molecular conocido. Al igual que las muestras de interés, el marcador también se derivatiza con un fluoróforo (generalmente con ácido 8-amino naftaleno -1,3,6- trisulfónico (ANTS) o 2- aminoacridona ). [36]

Referencias

  1. ^ Carlson, David P. "Marcadores de tamaño para análisis electroforético de ADN". Patente de EE. UU. n.° 5316908A . Google Patents . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  2. ^ Carlson, David P. "Marcadores de tamaño para análisis electroforético de ADN". Patente EP #0466404B1 . Google Patents . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  3. ^ abcdefghijklmnop Blaber, Mike. "Conferencia 20: Electroforesis en gel". BCH5425 Biología molecular y biotecnología .
  4. ^ Bowen, R (20 de octubre de 1999). "Ligamentación de ADN". Biotecnología e ingeniería genética . Consultado el 12 de noviembre de 2013 .
  5. ^ abc Lan, Vo Thi Thuong; Loan, Pham Thi Thanh; Duong, Pham Anh Thuy; Thanh, Le Thi; Ha, Ngo Thi; Thuan, Ta Bich (2012). "Procedimiento sencillo para la producción en laboratorio de una escalera de ADN". Journal of Nucleic Acids . 2012 : 254630. doi : 10.1155/2012/254630 . PMC 3306978 . PMID  22496965. 
  6. ^ abcdefg Bowen, R. (2000). "Electroforesis de ADN en gel de agarosa". Hipertextos para las ciencias biomédicas – Universidad Estatal de Colorado .
  7. ^ "Búfer Tris Borato EDTA y Tris-Acetato-EDTA (TAE y TBE, pH 8,3)" (PDF) . Aniara .
  8. ^ abc "Consejos y trucos para la electroforesis en gel de agarosa". Life Technologies .
  9. ^ Hartley, James. "Protein size marker ladder". Patente de EE. UU. n.º 5449758A . Google Patents . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  10. ^ Cheng, Tian Lu. "Kit de marcadores de peso molecular de proteínas de autodesarrollo y ponderación regular y método para prepararlos". Patente de EE. UU. n.° 20130217133A1 . Google Patents . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  11. ^ "Marcador de peso molecular de proteína preteñido". ThermoScientific . Consultado el 12 de noviembre de 2013 .
  12. ^ abcdef Ingelman, Margareta (2004). "Separación y análisis de proteínas". KE7001 Laboratorios de bioquímica . Consultado el 12 de noviembre de 2013 .
  13. ^ "Marcadores de peso molecular de proteínas". Help Biotech . 2011. Consultado el 12 de noviembre de 2013 .
  14. ^ abcdefgh "Guía de comparación y selección de marcadores de peso molecular de proteínas" . Consultado el 16 de noviembre de 2013 .
  15. ^ ab "Marcador de peso molecular biotinilado" . Consultado el 16 de noviembre de 2013 .
  16. ^ ab "Molecular Weight Markers" . Consultado el 16 de noviembre de 2013 .
  17. ^ ab "Marcador de peso molecular de proteína preteñido de Pierce" . Consultado el 16 de noviembre de 2013 .
  18. ^ abcdefghijklmn "Electroforesis: una guía para la electroforesis y detección en gel de poliacrilamida" (PDF) . Bio-Rad .
  19. ^ "Guía de selección y comparación de marcadores de peso molecular de proteínas". ThermoScientific . Consultado el 12 de noviembre de 2013 .
  20. ^ abcdefghi "Manual de proteínas 2013" (PDF) . Tecnologías de vida .
  21. ^ ab Kool, Eric T. "Vectores de ADN circulares para la síntesis de ARN y ADN". Patente de EE. UU. n.º 6096880A . Google Patents . Consultado el 27 de noviembre de 2013 .
  22. ^ Lonza. "Marcadores de ARN de 0,5 a 9 kbp" (PDF) . Documento n.° 18123-0807-06 . Lonza Rockland Inc. Consultado el 27 de noviembre de 2013 .
  23. ^ New England Biolabs. «microRNA Marker». New England Biolabs . Consultado el 27 de noviembre de 2013 .
  24. ^ Wicks, Richard J. (1986). "Determinación del peso molecular del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa utilizando formaldehído como desnaturalizante: comparación de marcadores de peso molecular de ARN y ADN". Revista Internacional de Bioquímica . 18 (3): 277–278. doi :10.1016/0020-711x(86)90118-7. PMID  2937672.
  25. ^ ab "Catálogo n.°: R0004". Marcador de ARN de alta facilidad . Abnova . Consultado el 14 de diciembre de 2013 .
  26. ^ "Electroforesis de ARN: Introducción". Electroforesis de ARN . Thermo Fisher Scientific Inc . Consultado el 14 de diciembre de 2013 .
  27. ^ "Determinación del peso molecular de las proteínas" (PDF) . Consultado el 14 de diciembre de 2013 .
  28. ^ abcdefgh Schlotterer, Christian. "La evolución de los marcadores moleculares" (PDF) . Consultado el 26 de noviembre de 2013 .
  29. ^ "Mejora de la población" . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  30. ^ Higgins, L. (abril de 2012). "Escalera de ADN para electroforesis en gel". Lewis & Clark College . Consultado el 15 de noviembre de 2013 .
  31. ^ ab Mueller, Ulrich (1999). "Genotipado y huellas dactilares de AFLP" (PDF) . Tendencias en ecología y evolución . 14 (10): 389–394. doi :10.1016/s0169-5347(99)01659-6. PMID  10481200. Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  32. ^ Invitrogen Corporation (2003). "30-330 bp AFLP® DNA Ladder" (PDF) . Manual . Life Technologies Corporation . Consultado el 15 de noviembre de 2013 .
  33. ^ Gianniny, Christine; et al. (mayo de 2004). "Análisis unRAPD de ADNmt de flores de tomate libre de artefactos de ADN nuclear" (PDF) . BioTechniques . 36 (5): 772–776. doi : 10.2144/04365BM04 . PMID  15152595 . Consultado el 15 de noviembre de 2013 .
  34. ^ Roberts, MA; Crawford, DL (1 de junio de 2000). "Uso de ADN polimórfico amplificado aleatoriamente como medio para desarrollar sondas de ADN de Streptomyces específicas de género y cepa". Applied and Environmental Microbiology . 66 (6): 2555–2564. doi :10.1128/AEM.66.6.2555-2564.2000. PMC 110581 . PMID  10831438. 
  35. ^ McClean, Phillip. "Las clases de marcadores moleculares" . Consultado el 30 de octubre de 2013 .
  36. ^ abcdefgh Kosik, Ondrej; Bromley, Jennifer R.; Busse-Wicher, Marta; Zhang, Zhinong; Dupree, Paul (2012). Estudios de escisión enzimática de celulosa mediante análisis de polisacáridos por electroforesis en gel de carbohidratos (PACE) . Métodos en enzimología. Vol. 510. págs. 51–67. doi :10.1016/B978-0-12-415931-0.00004-5. ISBN 9780124159310. ISSN  0076-6879. PMID  22608721.
  37. ^ Cammack R, Attwood TK, Campbell PN, Parish HJ, Smith A, Stirling JL, Vella F (2006). "Fluoróforo". Diccionario Oxford de bioquímica y biología molecular (segunda edición). Oxford University Press.