La eficiencia de transformación se refiere a la capacidad de una célula para captar e incorporar ADN exógeno, como plásmidos , durante un proceso llamado transformación . La eficiencia de la transformación se mide típicamente como la cantidad de transformantes (células que han captado el ADN exógeno ) por microgramo de ADN agregado a las células. Una mayor eficiencia de transformación significa que más células pueden captar el ADN, y una menor eficiencia significa que menos células pueden hacerlo.
En biología molecular , la eficiencia de transformación es un parámetro crucial que se utiliza para evaluar la capacidad de diferentes métodos para introducir ADN plasmídico en las células y para comparar la eficiencia de diferentes plásmidos , vectores y células hospedadoras. Esta eficiencia puede verse afectada por diversos factores, entre ellos el método utilizado para introducir el ADN, el tipo de célula y plásmido utilizado y las condiciones en las que se realiza la transformación. Por lo tanto, medir y optimizar la eficiencia de transformación es un paso importante en muchas aplicaciones de biología molecular, entre ellas la ingeniería genética , la terapia génica y la biotecnología .
Al medir la eficiencia de la transformación, podemos utilizar la información de nuestro experimento para evaluar la eficacia de nuestra transformación. Se trata de una cuantificación de cuántas células se alteraron con 1 μg de ADN plasmídico. En esencia, es una señal de que el experimento de transformación fue exitoso. [1] Debe determinarse en condiciones de exceso de células. [2]
La eficiencia de transformación se mide generalmente como el número de células transformadas por el número total de células. Puede representarse como un porcentaje o como unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de ADN.
Una de las formas más comunes de medir la eficiencia de transformación es mediante un ensayo de formación de colonias . A continuación, se muestra un ejemplo de cómo calcular la eficiencia de transformación utilizando unidades formadoras de colonias (UFC): [3]
Por ejemplo, si siembras 1x 10 7 células y cuentas 1000 colonias, la eficiencia de transformación es: (1000/1x 10 7 ) x 100 = 0,1 %
Alternativamente, las UFC se pueden informar por microgramo de ADN utilizado para la transformación. Esto se puede calcular multiplicando el número de colonias por el volumen del cultivo sembrado y dividiéndolo por la cantidad de ADN utilizado.
PCR cuantitativa (qPCR): este método aprovecha el hecho de que el ADN plasmídico tendrá un gen o secuencia específicos que no están presentes en el genoma de la célula huésped y, por lo tanto, se puede utilizar como objetivo para la qPCR. Al cuantificar el número de copias de este gen o secuencia específicos en las células transformadas, es posible determinar la cantidad de ADN plasmídico presente en la célula y, por lo tanto, la eficiencia de la transformación. [4]
Ensayo de fluorescencia : este método se basa en el uso de un plásmido que contiene una proteína fluorescente o un gen indicador. Las células transformadas se analizan luego mediante citometría de flujo o microscopía de fluorescencia para determinar la cantidad de células que expresan la proteína fluorescente . Luego, se calcula la eficiencia de la transformación como el porcentaje de células que expresan la proteína fluorescente. [5]
El número de células viables en una preparación para una reacción de transformación puede variar de 2×10 8 a 10 11 ; los métodos más comunes de preparación de E. coli producen alrededor de 10 10 células viables por reacción. Los plásmidos estándar utilizados para la determinación de la eficiencia de transformación en Escherichia coli son pBR322 u otros vectores de tamaño similar o más pequeños, como la serie de vectores pUC. Sin embargo, se pueden utilizar diferentes vectores para determinar su eficiencia de transformación. Se pueden utilizar entre 10 y 100 pg de ADN para la transformación, puede ser necesario más ADN para una transformación de baja eficiencia (generalmente el nivel de saturación se alcanza a más de 10 ng). [6]
Después de la transformación, se siembran por separado el 1% y el 10% de las células; las células pueden diluirse en el medio según sea necesario para facilitar la siembra. Se puede utilizar una dilución adicional para lograr una transformación de alta eficiencia.
Una eficiencia de transformación de 1×10 8 ufc/μg para un plásmido pequeño como pUC19 es aproximadamente equivalente a 1 en 2000 moléculas del plásmido utilizado que se introducen en las células. En E. coli , el límite teórico de la eficiencia de transformación para los plásmidos más utilizados sería de más de 1×10 11 ufc/μg. En la práctica, el mejor resultado alcanzable puede estar alrededor de 2–4×10 10 ufc/μg para un plásmido pequeño como pUC19, y considerablemente menor para plásmidos grandes.
Las células individuales son capaces de absorber muchas moléculas de ADN, pero la presencia de múltiples plásmidos no afecta significativamente la ocurrencia de eventos de transformación exitosos. [7] Varios factores pueden afectar la eficiencia de la transformación: [2]
Tamaño del plásmido : un estudio realizado en E. coli descubrió que la eficiencia de la transformación disminuye linealmente con el aumento del tamaño del plásmido , es decir, los plásmidos más grandes se transforman peor que los plásmidos más pequeños. [7] [8] [9]
Formas de ADN : los plásmidos superenrollados tienen una eficiencia de transformación ligeramente mejor que los plásmidos relajados; los plásmidos relajados se transforman con una eficiencia de alrededor del 75 % de los superenrollados. [7] Sin embargo, el ADN lineal y monocatenario tiene una eficiencia de transformación mucho menor. Los ADN monocatenarios se transforman con una eficiencia 10 4 menor que los de doble cadena.
Composición del medio : la composición del medio utilizado en el proceso de transformación puede afectar la eficiencia. Por ejemplo, ciertos suplementos del medio pueden aumentar la competencia natural de las células. [10]
Genotipo de células : las cepas de clonación pueden contener mutaciones que mejoran la eficiencia de transformación de las células. Por ejemplo, las cepas de E. coli K12 con la mutación deoR , que originalmente se descubrió que confiere a las células la capacidad de crecer en medios mínimos utilizando inosina como única fuente de carbono, tienen una eficiencia de transformación de 4 a 5 veces mayor que las cepas similares sin ella. En el caso del ADN lineal, que se transforma poco en E. coli , la mutación recBC o recD puede mejorar significativamente la eficiencia de su transformación. [11]
Condiciones de cultivo : las células de E. coli son más susceptibles de volverse competentes cuando crecen rápidamente, por lo que normalmente se recolectan en la fase logarítmica temprana del crecimiento celular cuando se preparan células competentes. La densidad óptica óptima para recolectar células normalmente se encuentra alrededor de 0,4, aunque puede variar con diferentes cepas celulares. También se ha descubierto que un valor más alto de 0,94-0,95 produce un buen rendimiento de células competentes, pero esto puede resultar poco práctico cuando el crecimiento celular es rápido. [12]
Presencia de antibióticos : la presencia de antibióticos puede aumentar la eficiencia de la transformación al inhibir el crecimiento de células no transformadas y seleccionar células transformadas que sean resistentes al antibiótico. Por ejemplo, se ha demostrado que el uso de antibióticos β-lactámicos en bacterias productoras de glutamato aumenta su eficiencia de transformación. [13] [14] [15]
Origen de replicación del plásmido : el origen de replicación del plásmido utilizado en el proceso de transformación puede afectar la eficiencia de varias maneras. El número de copias del plásmido en la célula, la actividad del origen de replicación en las células huésped y la expresión de los genes en el plásmido pueden afectar la eficiencia. El plásmido con un origen de replicación de alto número de copias generalmente tendrá una mayor eficiencia de transfección que uno con un origen de número de copias bajo; el uso de un plásmido con un origen de replicación que esté activo en la célula huésped puede conducir a una mayor eficiencia de transfección. [16]
Condiciones de transformación : el método de preparación de células competentes, la duración del choque térmico , la temperatura del choque térmico, el tiempo de incubación después del choque térmico, el medio de crecimiento utilizado, el pH y varios aditivos, todos pueden afectar la eficiencia de transformación de las células. La presencia de contaminantes, así como de ligasa en una mezcla de ligación, puede reducir la eficiencia de transformación en la electroporación [17] y la inactivación de la ligasa o la extracción de ADN con cloroformo pueden ser necesarias para la electroporación; alternativamente, solo se puede utilizar una décima parte de la mezcla de ligación para reducir la cantidad de contaminantes. La preparación normal de células competentes puede producir una eficiencia de transformación que va de 10 6 a 10 8 ufc/μg de ADN. Sin embargo, existen protocolos para el método químico para hacer células supercompetentes que pueden producir una eficiencia de transformación de más de 1 x 10 9 [18] .
Daño al ADN – La exposición del ADN a la radiación UV en un procedimiento estándar de electroforesis en gel de agarosa preparativa durante tan solo 45 segundos puede dañar el ADN, y esto puede reducir significativamente la eficiencia de transformación. [19] Sin embargo, agregar citidina o guanosina al tampón de electroforesis a una concentración de 1 mM puede proteger al ADN del daño. Se debe utilizar una radiación UV de mayor longitud de onda (365 nm) que cause menos daño al ADN si es necesario trabajar con el ADN en un transiluminador UV durante un período de tiempo prolongado. Esta radiación UV de mayor longitud de onda produce una fluorescencia más débil con el bromuro de etidio intercalado en el ADN, por lo tanto, si es necesario capturar imágenes de las bandas de ADN, se puede utilizar una radiación UV de longitud de onda más corta (302 o 312 nm). Sin embargo, dicha exposición debe limitarse a un tiempo muy corto si el ADN se va a recuperar más tarde para la ligadura y la transformación.
El método utilizado para introducir el ADN tiene un impacto significativo en la eficiencia de la transformación. [20]
La electroporación tiende a ser más eficiente que los métodos químicos y puede aplicarse a una amplia gama de especies y cepas que anteriormente eran resistentes y recalcitrantes a las técnicas de transformación. [21] [22]
Se ha descubierto que la electroporación tiene un rendimiento promedio típicamente entre 10 4 - 10 8 UFC/ug. Sin embargo, se pueden alcanzar eficiencias de transformación de hasta 0,5-5 x 10 10 unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de ADN para E. coli . Para muestras que son difíciles de manejar, como bibliotecas de ADNc , ADNg y plásmidos mayores de 30 kb, se sugiere utilizar células electrocompetentes que tengan eficiencias de transformación de más de 1 x 10 10 UFC/μg. Esto asegurará una alta tasa de éxito en la introducción del ADN y la formación de una gran cantidad de colonias. [23] Es importante ajustar y optimizar el tampón de electroporación (aumentar la concentración del tampón de electroporación puede resultar en mayores eficiencias de transformación) y la forma, fuerza, número y número de pulsos, estos parámetros eléctricos juegan un papel clave en la eficiencia de la transformación. [24]
La transformación química o el choque térmico se pueden realizar en un entorno de laboratorio sencillo, y normalmente producen eficiencias de transformación adecuadas para aplicaciones de clonación y subclonación, aproximadamente 10 6 UFC/μg. Uno de los primeros métodos utilizados fue una combinación de CaCl 2 y MgCl 2 para tratar las células. Sin embargo, estos métodos dieron como resultado eficiencias de transformación, con un máximo de 10 5 - 10 6 unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de ADN plasmídico. [23] Investigaciones posteriores descubrieron que ciertos cationes, como Mn 2+ , Ca 2+ , Ba 2+ , Sr 2+ y Mg 2+ podrían tener un efecto positivo en las eficiencias de transformación, siendo Mn 2+ el que muestra el mayor efecto. [25]
Algunas células bacterianas tienen sistemas de restricción-modificación que pueden degradar plásmidos exógenos que son extraños a la célula huésped. Esto puede reducir en gran medida la eficiencia de la transformación. [26] [20] Esto se debe a los sistemas de restricción en las células receptoras que apuntan y destruyen el ADN exógeno. Estos sistemas reconocen el ADN exógeno basándose en diferencias en los patrones de metilación. Para abordar este problema, se han aplicado estrategias como alterar la metilación del ADN exógeno utilizando metilasas comerciales o reducir la actividad de restricción en las células receptoras. [27] [28] Por ejemplo, el uso de mutantes negativos a la metilación o la inactivación temporal del sistema de restricción con calor puede reducir la capacidad de la célula receptora para imponer restricciones al ADN exógeno. [29]
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