Una biblioteca de ADNc es una combinación de fragmentos de ADNc ( ADN complementario ) clonados insertados en una colección de células huésped, que constituyen una parte del transcriptoma del organismo y se almacenan como una " biblioteca ". El ADNc se produce a partir de ARNm completamente transcrito que se encuentra en el núcleo y, por lo tanto, contiene sólo los genes expresados de un organismo. De manera similar, se pueden producir bibliotecas de ADNc específicas de tejido. En las células eucariotas , el ARNm maduro ya está empalmado , por lo que el ADNc producido carece de intrones y puede expresarse fácilmente en una célula bacteriana. Si bien la información en las bibliotecas de ADNc es una herramienta poderosa y útil ya que los productos genéticos se identifican fácilmente, las bibliotecas carecen de información sobre potenciadores , intrones y otros elementos reguladores que se encuentran en una biblioteca de ADN genómico . [1]
El ADNc se crea a partir de un ARNm maduro de una célula eucariota con el uso de transcriptasa inversa . En los eucariotas, una cola poli-(A) (que consta de una larga secuencia de nucleótidos de adenina) distingue el ARNm del ARNt y el ARNr y, por tanto, puede utilizarse como sitio cebador para la transcripción inversa. Esto tiene el problema de que no todos los transcritos, como los de la histona , codifican una cola poli-A . [2]
En primer lugar, es necesario aislar la plantilla de ARNm para la creación de bibliotecas de ADNc. Dado que el ARNm solo contiene exones, se debe considerar la integridad del ARNm aislado para que aún se pueda producir la proteína codificada. El ARNm aislado debe oscilar entre 500 pb y 8 kb. [3] Existen varios métodos para purificar el ARN, como la extracción con trizol y la purificación en columna . La purificación en columna se puede realizar utilizando resinas oligoméricas recubiertas de nucleótidos dT, y se pueden aprovechar características del ARNm, como tener una cola poli-A, donde solo se unirán secuencias de ARNm que contengan dicha característica. Luego se eluye el ARNm deseado unido a la columna .
Una vez que se purifica el ARNm, se une un cebador oligo-dT (una secuencia corta de nucleótidos de desoxitimidina) a la cola poli-A del ARN. El cebador es necesario para iniciar la síntesis de ADN mediante la enzima transcriptasa inversa . Esto da como resultado la creación de híbridos de ARN-ADN donde una sola hebra de ADN complementario se une a una hebra de ARNm. [4] Para eliminar el ARNm, se utiliza la enzima ARNasa H para escindir la columna vertebral del ARNm y generar grupos 3'-OH libres, lo cual es importante para la sustitución del ARNm por ADN. [3] Luego se agrega la ADN polimerasa I, el ARN escindido actúa como un cebador que la ADN polimerasa I puede identificar e iniciar el reemplazo de los nucleótidos del ARN por los del ADN. [3] Esto lo proporciona el propio sscDNA al enrollarse sobre sí mismo en el extremo 3', generando un bucle en forma de horquilla . La polimerasa extiende el extremo 3'-OH y luego el bucle en el extremo 3' se abre mediante la acción de tijera de la nucleasa S1 . Luego se utilizan endonucleasas de restricción y ADN ligasa para clonar las secuencias en plásmidos bacterianos .
Luego se seleccionan las bacterias clonadas, comúnmente mediante el uso de selección de antibióticos. Una vez seleccionadas, se crean reservas de bacterias que luego pueden cultivarse y secuenciarse para compilar la biblioteca de ADNc.
Las bibliotecas de ADNc se utilizan comúnmente cuando se reproducen genomas eucariotas, ya que la cantidad de información se reduce para eliminar una gran cantidad de regiones no codificantes de la biblioteca. Las bibliotecas de ADNc se utilizan para expresar genes eucarióticos en procariotas. Los procariotas no tienen intrones en su ADN y, por lo tanto, no poseen enzimas que puedan eliminarlo durante el proceso de transcripción. El ADNc no tiene intrones y, por tanto, puede expresarse en células procarióticas. Las bibliotecas de ADNc son más útiles en genética inversa, donde la información genómica adicional es de menor utilidad. Además, las bibliotecas de ADNc se utilizan con frecuencia en la clonación funcional para identificar genes según la función de la proteína codificada. Cuando se estudia el ADN eucariota, se construyen bibliotecas de expresión utilizando ADN complementario (ADNc) para ayudar a garantizar que el inserto sea realmente un gen. [4]
La biblioteca de ADNc carece de los elementos reguladores y no codificantes que se encuentran en el ADN genómico. Las bibliotecas de ADN genómico proporcionan información más detallada sobre el organismo, pero su generación y conservación requieren más recursos.
Las moléculas de ADNc se pueden clonar utilizando conectores de sitios de restricción. Los conectores son fragmentos cortos de ADN de doble cadena ( oligodesoxirribonucleótido ) de aproximadamente 8 a 12 pares de nucleótidos de largo que incluyen un sitio de escisión de endonucleasa de restricción , por ejemplo, BamHI. Tanto el ADNc como el conector tienen extremos romos que pueden ligarse entre sí usando una alta concentración de ADN ligasa T4. Luego se producen extremos pegajosos en la molécula de ADNc escindiendo los extremos del ADNc (que ahora tienen conectores con un sitio incorporado) con la endonucleasa apropiada. A continuación, también se escinde un vector de clonación ( plásmido ) con la endonucleasa adecuada. Después de la ligadura del " extremo adhesivo " del inserto en el vector, la molécula de ADN recombinante resultante se transfiere a la célula huésped de E. coli para su clonación.
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