La genética inversa es un método de genética molecular que se utiliza para ayudar a comprender la función de un gen mediante el análisis de los efectos fenotípicos causados por la ingeniería genética de secuencias específicas de ácidos nucleicos dentro del gen. El proceso se lleva a cabo en la dirección opuesta a las pruebas genéticas directas de la genética clásica . Mientras que la genética directa busca encontrar la base genética de un fenotipo o rasgo, la genética inversa busca encontrar qué fenotipos están controlados por secuencias genéticas particulares.
La secuenciación automatizada del ADN genera grandes volúmenes de datos de secuencias genómicas con relativa rapidez. Muchas secuencias genéticas se descubren antes que otra información biológica que se obtiene con menos facilidad. La genética inversa intenta relacionar una secuencia genética dada con efectos específicos en el organismo. [1] Los sistemas de genética inversa también pueden permitir la recuperación y generación de virus infecciosos o defectuosos con mutaciones deseadas. [2] Esto permite estudiar el virus in vitro e in vivo .
Para conocer la influencia que tiene una secuencia en el fenotipo o para descubrir su función biológica, los investigadores pueden modificar o alterar el ADN . Una vez realizado el cambio, el investigador puede buscar el efecto de dichas alteraciones en todo el organismo . Existen varios métodos diferentes de genética inversa:
La mutagénesis dirigida es una técnica sofisticada que puede cambiar regiones reguladoras en el promotor de un gen o hacer cambios sutiles en los codones en el marco de lectura abierto para identificar residuos de aminoácidos importantes para la función de la proteína . [ cita requerida ]
Alternativamente, la técnica puede utilizarse para crear alelos nulos de modo que el gen no sea funcional. Por ejemplo, la eliminación de un gen mediante la selección de genes ( knockout genético ) se puede realizar en algunos organismos, como la levadura , los ratones y el musgo . Única entre las plantas, en Physcomitrella patens , el knockout genético mediante recombinación homóloga para crear musgo knockout (ver figura) es casi tan eficiente como en la levadura. [4] En el caso del sistema modelo de levadura se han creado deleciones dirigidas en cada gen no esencial en el genoma de la levadura. [5] En el caso del sistema modelo de planta se han creado enormes bibliotecas de mutantes basadas en construcciones de disrupción genética. [6] En el knock-in genético , el exón endógeno se reemplaza por una secuencia alterada de interés. [7]
En algunos casos, se pueden utilizar alelos condicionales para que el gen tenga una función normal hasta que se active el alelo condicional. Esto podría implicar la "activación" de sitios de recombinasa (como los sitios lox o frt) que causarán una deleción en el gen de interés cuando se induce una recombinasa específica (como CRE, FLP). Las recombinasas Cre o Flp se pueden inducir con tratamientos químicos, tratamientos de choque térmico o restringirse a un subconjunto específico de tejidos. [ cita requerida ]
Otra técnica que se puede utilizar es TILLING . Se trata de un método que combina una técnica estándar y eficiente de mutagénesis con un mutágeno químico como el metanosulfonato de etilo (EMS) con una técnica sensible de cribado de ADN que identifica mutaciones puntuales en un gen diana. [ cita requerida ]
En el campo de la virología, las técnicas de genética inversa se pueden utilizar para recuperar virus infecciosos de longitud completa con mutaciones deseadas o inserciones en los genomas virales o en genes virales específicos. Las tecnologías que permiten estas manipulaciones incluyen la reacción de extensión de polimerasa circular (CPER), que se utilizó por primera vez para generar ADNc infeccioso para el virus Kunjin, un pariente cercano del virus del Nilo Occidental. [8] La CPER también se ha utilizado con éxito para generar una variedad de virus de ARN de sentido positivo como el SARS-CoV-2, [9] el agente causante de COVID-19.
El descubrimiento del silenciamiento de genes mediante ARN de doble cadena, también conocido como interferencia de ARN (RNAi), y el desarrollo de la eliminación de genes mediante oligos de morfolino han hecho que la alteración de la expresión genética sea una técnica accesible para muchos más investigadores. Este método se conoce a menudo como eliminación de genes, ya que los efectos de estos reactivos son generalmente temporales, en contraste con las eliminaciones de genes , que son permanentes. [ cita requerida ]
El ARNi crea un efecto de knock out específico sin llegar a mutar el ADN de interés. En C. elegans , el ARNi se ha utilizado para interferir sistemáticamente con la expresión de la mayoría de los genes del genoma. El ARNi actúa ordenando a los sistemas celulares que degraden el ARN mensajero (ARNm) objetivo. [ cita requerida ]
La interferencia de ARNi, en concreto el silenciamiento génico, se ha convertido en una herramienta útil para silenciar la expresión de genes e identificar y analizar su fenotipo de pérdida de función. Cuando se producen mutaciones en alelos, la función que representa y codifica también se muta y se pierde; esto se denomina generalmente mutación de pérdida de función. [10] La capacidad de analizar el fenotipo de pérdida de función permite analizar la función de los genes cuando no se tiene acceso a los alelos mutantes. [11]
Si bien la interferencia del ARN depende de componentes celulares para su eficacia (por ejemplo, las proteínas Dicer, el complejo RISC), una alternativa simple para la inhibición de genes son los oligos antisentido de morfolino . Los morfolinos se unen y bloquean el acceso al ARNm objetivo sin requerir la actividad de proteínas celulares y sin acelerar necesariamente la degradación del ARNm. Los morfolinos son eficaces en sistemas que varían en complejidad desde la traducción sin células en un tubo de ensayo hasta estudios in vivo en modelos animales grandes. [ cita requerida ]
Un enfoque genético molecular consiste en la creación de organismos transgénicos que sobreexpresan un gen normal de interés. El fenotipo resultante puede reflejar la función normal del gen.
Alternativamente, es posible sobreexpresar formas mutantes de un gen que interfieran con la función del gen normal ( de tipo salvaje ). Por ejemplo, la sobreexpresión de un gen mutante puede dar como resultado niveles elevados de una proteína no funcional, lo que da lugar a una interacción negativa dominante con la proteína de tipo salvaje. En este caso, la versión mutante competirá con las proteínas de tipo salvaje asociadas, lo que dará lugar a un fenotipo mutante.
Otras formas mutantes pueden dar como resultado una proteína que está regulada de manera anormal y constitutivamente activa ("activa" todo el tiempo). Esto podría deberse a la eliminación de un dominio regulador o a la mutación de un residuo amino específico que se modifica de manera reversible (por fosforilación , metilación o ubiquitinación ). Cualquier cambio es fundamental para modular la función de la proteína y, a menudo, da como resultado fenotipos informativos.
La genética inversa desempeña un papel importante en la síntesis de vacunas . Las vacunas se pueden crear mediante la ingeniería de nuevos genotipos de cepas virales infecciosas que disminuyen su potencia patógena lo suficiente como para facilitar la inmunidad en un huésped. El enfoque de la genética inversa para la síntesis de vacunas utiliza secuencias genéticas virales conocidas para crear un fenotipo deseado: un virus con una potencia patológica debilitada y una similitud con la cepa viral circulante actual. La genética inversa proporciona una alternativa conveniente al método tradicional de creación de vacunas inactivadas , virus que han sido eliminados mediante calor u otros métodos químicos.
Las vacunas creadas mediante métodos de genética inversa se conocen como vacunas atenuadas , llamadas así porque contienen virus vivos debilitados (atenuados). Las vacunas atenuadas se crean combinando genes de una cepa viral nueva o actual con virus previamente atenuados de la misma especie. [12] Los virus atenuados se crean propagando un virus vivo en condiciones nuevas, como un huevo de gallina. Esto produce una cepa viral que todavía está viva, pero no es patógena para los humanos, [13] ya que estos virus se vuelven defectuosos en el sentido de que no pueden replicar su genoma lo suficiente para propagarse e infectar suficientemente a un huésped. Sin embargo, los genes virales aún se expresan en la célula del huésped a través de un solo ciclo de replicación, lo que permite el desarrollo de una inmunidad. [14]
Una forma habitual de crear una vacuna mediante técnicas de genética inversa es utilizar plásmidos para sintetizar virus atenuados. Esta técnica se utiliza con mayor frecuencia en la producción anual de vacunas contra la gripe , donde un sistema de ocho plásmidos puede producir rápidamente una vacuna eficaz. El genoma completo del virus de la gripe A consta de ocho segmentos de ARN, por lo que la combinación de seis plásmidos de ADNc viral atenuados con dos plásmidos de tipo salvaje permite construir una cepa de vacuna atenuada. Para el desarrollo de vacunas contra la gripe, los segmentos de ARN cuarto y sexto, que codifican las proteínas hemaglutinina y neuraminidasa respectivamente, se toman del virus circulante, mientras que los otros seis segmentos se derivan de una cepa maestra previamente atenuada. Las proteínas HA y NA presentan una gran variedad de antígenos y, por lo tanto, se toman de la cepa actual para la que se está produciendo la vacuna para crear una vacuna que coincida bien. [12]
El plásmido utilizado en este sistema de ocho plásmidos contiene tres componentes principales que permiten el desarrollo de vacunas. En primer lugar, el plásmido contiene sitios de restricción que permitirán la incorporación de genes de la gripe en el plásmido. En segundo lugar, el plásmido contiene un gen de resistencia a los antibióticos, lo que permite la selección de plásmidos que contienen únicamente el gen correcto. Por último, el plásmido contiene dos promotores, el promotor pol 1 humano y el promotor pol 2 que transcriben genes en direcciones opuestas. [15]
Las secuencias de ADNc del ARN viral se sintetizan a partir de cepas maestras atenuadas mediante RT-PCR . [12] Luego, este ADNc se puede insertar entre un promotor de la ARN polimerasa I (Pol I) y una secuencia terminadora mediante digestión con enzimas de restricción. Luego, la secuencia de ADNc y pol I se rodea a su vez por un promotor de la ARN polimerasa II (Pol II) y un sitio de poliadenilación . [16] Luego, esta secuencia completa se inserta en un plásmido. Seis plásmidos derivados del ADNc de la cepa maestra atenuada se cotransfectan en una célula diana, a menudo un huevo de gallina, junto con dos plásmidos de la cepa de influenza de tipo salvaje que circula actualmente. Dentro de la célula diana, las dos enzimas Pol I y Pol II "apiladas" transcriben el ADNc viral para sintetizar tanto el ARN viral de sentido negativo como el ARNm de sentido positivo, creando efectivamente un virus atenuado. [12] El resultado es una cepa de vacuna defectuosa que es similar a la cepa de virus actual, lo que permite que un huésped desarrolle inmunidad. Esta cepa de vacuna sintetizada puede luego utilizarse como virus semilla para crear más vacunas.
Las vacunas diseñadas a partir de genética inversa tienen varias ventajas sobre los diseños de vacunas tradicionales. La más notable es la velocidad de producción. Debido a la alta variación antigénica en las glicoproteínas HA y NA , un enfoque de genética inversa permite que el genotipo necesario (es decir, uno que contenga proteínas HA y NA tomadas de cepas de virus actualmente circulantes) se formule rápidamente. [12] Además, dado que el producto final de la producción de una vacuna atenuada de genética inversa es un virus vivo, se exhibe una inmunogenicidad mayor que en las vacunas inactivadas tradicionales, [17] que deben eliminarse mediante procedimientos químicos antes de transferirse como vacuna. Sin embargo, debido a la naturaleza viva de los virus atenuados, pueden surgir complicaciones en pacientes inmunodeficientes . [18] También existe la posibilidad de que una mutación en el virus pueda hacer que la vacuna vuelva a convertirse en un virus vivo no atenuado. [19]