En microbiología , una unidad formadora de colonias ( UFC, ufc o UFC ) es una unidad que estima el número de células microbianas ( bacterias , hongos , virus , etc.) en una muestra que son viables , capaces de multiplicarse mediante fisión binaria bajo condiciones controladas. condiciones. Para contar las unidades formadoras de colonias es necesario cultivar los microbios y contar sólo las células viables, a diferencia del examen microscópico que cuenta todas las células, vivas o muertas. La apariencia visual de una colonia en un cultivo celular requiere un crecimiento significativo y, al contar las colonias , no se sabe si la colonia surgió de una sola célula o de un grupo de células. Expresar los resultados como unidades formadoras de colonias refleja esta incertidumbre.
Teoría
El propósito del recuento en placa es estimar el número de células presentes en función de su capacidad para dar lugar a colonias en condiciones específicas de temperatura, tiempo y medio nutritivo. Teóricamente, una célula viable puede dar lugar a una colonia mediante replicación. Sin embargo, las células solitarias son una excepción en la naturaleza y, en la mayoría de los casos, el progenitor de una colonia es una masa de células depositadas juntas. [1] [2] Además, muchas bacterias crecen en cadenas (por ejemplo, Streptococcus ) o grupos (por ejemplo, Staphylococcus ). La estimación del número de microbios mediante UFC, en la mayoría de los casos, subestimará el número de células vivas presentes en una muestra por estos motivos. Esto se debe a que el recuento de UFC supone que cada colonia está separada y fundada por una única célula microbiana viable. [3]
El recuento en placa es lineal para E. coli en el rango de 30 a 300 UFC en una placa de Petri de tamaño estándar . [4] Por lo tanto, para garantizar que una muestra produzca UFC en este rango es necesario diluir la muestra y sembrar en placas varias diluciones. Normalmente, se utilizan diluciones diez veces mayores y la serie de diluciones se siembra en réplicas de 2 o 3 en el rango de diluciones elegido. A menudo se siembran en placas 100 μL, pero también se utilizan cantidades mayores, de hasta 1 ml. Los volúmenes de recubrimiento más altos aumentan los tiempos de secado, pero a menudo no dan como resultado una mayor precisión, ya que pueden ser necesarios pasos de dilución adicionales. [5] Las UFC/placa se leen de una placa en el rango lineal y luego las UFC/g (o UFC/mL) del original se deducen matemáticamente, teniendo en cuenta la cantidad sembrada y su factor de dilución.
Una ventaja de este método es que diferentes especies microbianas pueden dar lugar a colonias que son claramente diferentes entre sí, tanto microscópica como macroscópicamente . La morfología de la colonia puede ser de gran utilidad en la identificación del microorganismo presente. [6]
Una comprensión previa de la anatomía microscópica del organismo puede brindar una mejor comprensión de cómo las UFC/mL observadas se relacionan con la cantidad de células viables por mililitro. Alternativamente, en algunos casos es posible disminuir el número promedio de células por UFC agitando la muestra antes de realizar la dilución. Sin embargo, muchos microorganismos son delicados y sufrirían una disminución en la proporción de células viables si se colocaran en un vórtice. [7]
Las unidades formadoras de colonias se utilizan para cuantificar los resultados en muchos métodos de recuento y siembra microbiológica, entre ellos:
El método de vertido en placa en el que la muestra se suspende en una placa de Petri utilizando agar fundido enfriado a aproximadamente 40–45 °C (justo por encima del punto de solidificación para minimizar la muerte celular inducida por el calor). Una vez que el agar nutritivo se solidifica, se incuba la placa. [11]
El método de placa extendida en el que la muestra (en un volumen pequeño) se extiende sobre la superficie de una placa de agar nutritivo y se deja secar antes de la incubación para el recuento. [11]
El método de filtro de membrana en el que la muestra se filtra a través de un filtro de membrana y luego el filtro se coloca sobre la superficie de una placa de agar nutritivo. Durante la incubación, los nutrientes se filtran a través del filtro para apoyar las células en crecimiento. Como el área de superficie de la mayoría de los filtros es menor que la de una placa de Petri estándar, el rango lineal del recuento de la placa será menor. [11]
Los métodos de Miles y Misra o método de placa de gota en el que se deja caer una alícuota muy pequeña (normalmente unos 10 microlitros) de muestra de cada dilución en serie sobre una placa de Petri. El plato de goteo debe leerse mientras las colonias son muy pequeñas para evitar la pérdida de UFC a medida que crecen juntas. [12]
Sin embargo, con las técnicas que requieren el uso de una placa de agar, no se puede utilizar ninguna solución fluida porque no se puede identificar la pureza de la muestra y no es posible contar las células una por una en el líquido. [13]
Herramientas para contar colonias.
El recuento de colonias se realiza tradicionalmente de forma manual utilizando un bolígrafo y un contador de clics. Esta es generalmente una tarea sencilla, pero puede resultar muy laboriosa y consumir mucho tiempo cuando es necesario enumerar muchas placas. Alternativamente, se pueden utilizar soluciones semiautomáticas (software) y automáticas (hardware + software). [14] [15] [16]
Software para contar UFC
Las colonias se pueden enumerar a partir de fotografías de placas utilizando herramientas de software. Los experimentadores generalmente toman una fotografía de cada placa que necesitan contar y luego analizan todas las imágenes (esto se puede hacer con una simple cámara digital o incluso una cámara web). Dado que se necesitan menos de 10 segundos para tomar una sola fotografía, a diferencia de varios minutos para contar las UFC manualmente, este método generalmente ahorra mucho tiempo. Además, es más objetivo y permite extraer otras variables como el tamaño y color de las colonias. [16]
OpenCFU es un programa gratuito y de código abierto diseñado para optimizar la facilidad de uso, la velocidad y la solidez. Ofrece una amplia gama de filtros y controles, así como una interfaz de usuario moderna. OpenCFU está escrito en C++ y utiliza OpenCV para el análisis de imágenes. [17]
NICE es un programa escrito en MATLAB que proporciona una manera sencilla de contar colonias a partir de imágenes. [18]
ImageJ y CellProfiler : algunas macros y complementos de ImageJ [19] y algunas canalizaciones de CellProfiler [20] se pueden utilizar para contar colonias. Esto a menudo requiere que el usuario cambie el código para lograr un flujo de trabajo eficiente, pero puede resultar útil y flexible. Un problema principal es la ausencia de una GUI específica que puede hacer que la interacción con los algoritmos de procesamiento sea tediosa.
Además del software basado en computadoras de escritorio tradicionales, hay aplicaciones disponibles para dispositivos Android e iOS para el recuento de colonias automatizado y semiautomático. La cámara integrada se utiliza para tomar fotografías de la placa de agar y se utiliza un algoritmo interno o externo para procesar los datos de las imágenes y estimar el número de colonias. [21] [22] [23]
Sistemas automatizados
Muchos de los sistemas automatizados se utilizan para contrarrestar el error humano, ya que muchas de las técnicas de investigación realizadas por humanos que cuentan células individuales tienen una alta probabilidad de error. Debido al hecho de que los investigadores cuentan regularmente las células manualmente con la ayuda de una luz transmitida, esta técnica propensa a errores puede tener un efecto significativo en la concentración calculada en el medio líquido principal cuando las células están en cantidades bajas. [24]
Algunos fabricantes de biotecnología también ofrecen sistemas completamente automatizados. [25] [26] Generalmente son costosos y no tan flexibles como el software independiente, ya que el hardware y el software están diseñados para funcionar juntos para una configuración específica. [18]
Alternativamente, algunos sistemas automáticos utilizan el paradigma de revestimiento en espiral . [27]
Algunos de los sistemas automatizados como los sistemas de MATLAB permiten contar las células sin tener que teñirlas. Esto permite reutilizar las colonias para otros experimentos sin el riesgo de matar los microorganismos con las tinciones. Sin embargo, una desventaja de estos sistemas automatizados es que es extremadamente difícil diferenciar entre los microorganismos con polvo o rayones en placas de agar sangre porque tanto el polvo como los rayones pueden crear una combinación muy diversa de formas y apariencias. [28]
Unidades alternativas
En lugar de unidades formadoras de colonias, se pueden utilizar los parámetros Número más probable (MPN) y Unidades Fishman modificadas (MFU) [29] . El método del número más probable cuenta células viables y es útil cuando se enumeran concentraciones bajas de células o se enumeran microbios en productos donde las partículas hacen que el recuento en placa no sea práctico. [30] Las unidades Fishman modificadas tienen en cuenta bacterias que son viables, pero no cultivables.
^ Amann, RI; Luis, W; Schleifer, KH (1995). "Identificación filogenética y detección in situ de células microbianas individuales sin cultivo". Revisiones microbiológicas . 59 (1): 143–169. doi :10.1128/sr.59.1.143-169.1995. ISSN 0146-0749. PMC 239358 . PMID 7535888.
^ Staley, James T.; Konopka, Allan (1985). "Medición de las actividades in situ de microorganismos no fotosintéticos en hábitats acuáticos y terrestres". Revista Anual de Microbiología . 39 (1): 321–346. doi : 10.1146/annurev.mi.39.100185.001541. ISSN 0066-4227. PMID 3904603.
^ Goldman, Emanuel; Verde, Lorrence H (24 de agosto de 2008). Manual práctico de microbiología, segunda edición (Google eBook) (Segunda ed.). Estados Unidos: CRC Press, Taylor and Francis Group. pag. 864.ISBN978-0-8493-9365-5. Consultado el 16 de octubre de 2014 .
^ Raza, RS; Dotterrer, WD (mayo de 1916). "El número de colonias permitidas en placas de agar satisfactorias". Revista de Bacteriología . 1 (3): 321–31. doi :10.1128/JB.1.3.321-331.1916. PMC 378655 . PMID 16558698.
^ Schug, Ángela R.; Bartel, Alejandro; Meurer, Marita; Scholtzek, Anissa D.; Brombach, Julián; Hensel, Vivian; Fanning, Séamus; Schwarz, Stefan; Feßler, Andrea T. (1 de diciembre de 2020). "Comparación de dos métodos para la determinación del recuento de células en el curso de pruebas de susceptibilidad a biocidas". Microbiología Veterinaria . 251 : 108831. doi : 10.1016/j.vetmic.2020.108831. PMID 33202368. S2CID 225308316.
^ Badieyan, Saeedesadat; Dilmaghani-Marand, Arezou; Hajipour, Mohammad Javad; Ameri, Ali; Razzaghi, Mohammad Reza; Rafii-Tabar, Hashem; Mahmoudi, Morteza; Sasanpour, Pezhman (17 de julio de 2018). "Detección y discriminación de colonias bacterianas con imágenes de matriz de Mueller". Informes científicos . 8 (1): 10815. doi :10.1038/s41598-018-29059-5. ISSN 2045-2322. PMC 6050273 . PMID 30018335.
^ Foladori, Paola; Laura, Bruni; Gianni, Andreottola; Giuliano, Ziglio (2007). "Efectos de la sonicación sobre la viabilidad de las bacterias en plantas de tratamiento de aguas residuales evaluados mediante citometría de flujo: indicadores fecales, aguas residuales y lodos activados". Investigación del agua . 41 (1): 235–243. doi :10.1016/j.waters.2006.08.021. PMID 17052743.
^ "Unidades formadoras de colonias Log10 por gramo". Enciclopedia Titi Tudorancea . Consultado el 25 de septiembre de 2016 .
^ Fung, Daniel YC (2009). "Recuentos de células viables". Biociencia Internacional . Consultado el 25 de septiembre de 2016 .
^ Cole, Martin (1 de noviembre de 2005). "Principios de las pruebas microbiológicas: base estadística del muestreo" (PDF) . Comisión Internacional de Especificaciones Microbiológicas para Alimentos (ICMSF). Archivado desde el original (PDF) el 31 de octubre de 2017 . Consultado el 25 de septiembre de 2016 .
^ abc "USP 61: Pruebas de enumeración microbiana". Farmacopea de Estados Unidos . Consultado el 21 de mayo de 2024 .
^ Whitmire, Jeannette M.; Merrell, D. Scott (2012), Houghton, JeanMarie (ed.), "Técnicas de cultivo exitosas para especies de Helicobacter: técnicas generales de cultivo para Helicobacter pylori", Especies de Helicobacter , Métodos en biología molecular, vol. 921, Totowa, Nueva Jersey: Humana Press, págs. 17–27, doi :10.1007/978-1-62703-005-2_4, ISBN978-1-62703-004-5, PMID 23015487 , consultado el 1 de diciembre de 2023
^ Reynolds, Jackie. "Protocolos de dilución en serie". www.microbelibrary.org . Archivado desde el original el 17 de noviembre de 2015 . Consultado el 15 de noviembre de 2015 .
^ Brugger, Silvio D.; Baumberger, cristiano; Jost, Marcel; Jenni, Werner; Brugger, Urs; Mühlemann, Kathrin (20 de marzo de 2012). Bereswill, Stefan (ed.). "Recuento automatizado de unidades formadoras de colonias bacterianas en placas de agar". MÁS UNO . 7 (3): e33695. Código Bib : 2012PLoSO...733695B. doi : 10.1371/journal.pone.0033695 . ISSN 1932-6203. PMC 3308999 . PMID 22448267.
^ Khan, Arif ul Maula; Torelli, Ángel; Lobo, Ivo; Gretz, Norbert (8 de mayo de 2018). "AutoCellSeg: análisis celular/unidad formadora de colonias (UFC) automático robusto que utiliza segmentación de imágenes adaptativa y técnicas de posedición fáciles de usar". Informes científicos . 8 (1): 7302. doi :10.1038/s41598-018-24916-9. ISSN 2045-2322. PMC 5940850 . PMID 29739959.
^ ab Zhang, Louis (5 de noviembre de 2022). "Aprendizaje automático para la enumeración de unidades formadoras de colonias celulares". Computación visual para la industria, la biomedicina y el arte . 5 (1): 26. doi : 10.1186/s42492-022-00122-3 . ISSN 2524-4442. PMC 9637067 . PMID 36334176.
^ Geissmann, Quentin (2013). "OpenCFU, un nuevo software gratuito y de código abierto para contar colonias de células y otros objetos circulares". MÁS UNO . 8 (2): e54072. arXiv : 1210.5502 . Código Bib : 2013PLoSO...854072G. doi : 10.1371/journal.pone.0054072 . PMC 3574151 . PMID 23457446.
^ ab Clarke, Matthew L.; Burton, Robert L.; Colina, A. Nayo; Litorja, Maritoni; Nahm, Luna H.; Hwang, Jeeseong (agosto de 2010). "Recuento automatizado de colonias bacterianas de bajo costo, alto rendimiento". Citometría Parte A. 77 (8): 790–797. doi :10.1002/cyto.a.20864. PMC 2909336 . PMID 20140968.
^ Cai, Zhongli; Chattopadhyay, Niladri; Liu, Wenchao Jessica; Chan, Conrado; Pignol, Jean-Philippe; Reilly, Raymond M. (noviembre de 2011). "Recuento digital optimizado de colonias de ensayos clonogénicos utilizando el software ImageJ y macros personalizadas: comparación con el recuento manual". Revista internacional de biología de la radiación . 87 (11): 1135-1146. doi :10.3109/09553002.2011.622033. PMID 21913819. S2CID 25417288.
^ Bray, Mark-Anthony; Vokes, Martha S.; Carpenter, Anne E. (enero de 2015). "Uso de CellProfiler para la identificación y medición automática de objetos biológicos en imágenes". Protocolos actuales en biología molecular . 109 (1): 14.17.1–14.17.13. doi :10.1002/0471142727.mb1417s109. PMC 4302752 . PMID 25559103.
^ Arduengo, Michele (29 de marzo de 2013). "Ahora disponible para su compra: aplicación Promega Colony Counter". Conexiones Promega .
^ Moucka, Michael; Muigg, Verónica; Schlotterbeck, Ann-Kathrin; Stöger, Laurent; Gensch, Alejandro; Heller, Stefanie; Egli, Adrian (agosto de 2022). "Rendimiento de cuatro aplicaciones de recuento de células bacterianas para teléfonos inteligentes". Revista de métodos microbiológicos . 199 : 106508. doi : 10.1016/j.mimet.2022.106508 . PMID 35691441.
^ Austerjost, Jonás; Marquard, Daniel; Raddatz, Lucas; Geier, Dominik; Becker, Thomas; Scheper, Thomas; Lindner, Patricio; Beutel, Sascha (agosto de 2017). "Una aplicación de dispositivo inteligente para la determinación automatizada de colonias de E. coli en placas de agar". Ingeniería en Ciencias de la Vida . 17 (8): 959–966. doi : 10.1002/elsc.201700056 . ISSN 1618-0240. PMC 6999497 . PMID 32624845.
^ Jarvis, albahaca (2016). "Errores asociados a los procedimientos de recuento de colonias". Aspectos estadísticos del examen microbiológico de los alimentos . Elsevier: 119-140. doi :10.1016/b978-0-12-803973-1.00007-3. ISBN978-0-12-803973-1.
^ Heuser, Elisa; Becker, Karsten; Idelevich, Evgeny A. (17 de agosto de 2023). "Evaluación de un sistema automatizado para el recuento de colonias microbianas". Espectro de Microbiología . 11 (4): e00673-23. doi :10.1128/espectro.00673-23. PMC 10433998 . PMID 37395656.
^ "Contador de colonias completamente automático mediante vídeo de equipos de laboratorio AAA". LabTube . 7 de agosto de 2015 . Consultado el 28 de septiembre de 2018 .
^ Gilchrist, JE; Campbell, JE; Donnelly, CB; Pelador, JT; Delaney, JM (1973). "Método de placa en espiral para la determinación de bacterias". Microbiología Aplicada . 25 (2): 244–252. doi : 10.1128/am.25.2.244-252.1973. ISSN 0003-6919. PMC 380780 . PMID 4632851.
^ Brugger, Silvio D.; Baumberger, cristiano; Jost, Marcel; Jenni, Werner; Brugger, Urs; Mühlemann, Kathrin (20 de marzo de 2012). "Recuento automatizado de unidades formadoras de colonias bacterianas en placas de agar". MÁS UNO . 7 (3): e33695. Código Bib : 2012PLoSO...733695B. doi : 10.1371/journal.pone.0033695 . ISSN 1932-6203. PMC 3308999 . PMID 22448267.
^ Dehority, Licenciatura en Letras; Tirabasso, Pensilvania; Grifo, AP (1989). "Procedimientos de número más probable para enumerar bacterias ruminales, incluida la estimación simultánea de números totales y celulolíticos en un medio". Microbiología Aplicada y Ambiental . 55 (11): 2789–2792. doi :10.1128/aem.55.11.2789-2792.1989. ISSN 0099-2240. PMC 203169 . PMID 2624460.
^ Blodgett, Robert (octubre de 2010). "Manual de análisis bacteriano: número más probable de diluciones en serie". Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos .
Lectura adicional
Fishman, William H.; Bernfeld, Peter (1955). [31] Glucuronidasas . Métodos en enzimología. vol. 1. págs. 262–9. doi :10.1016/0076-6879(55)01035-5. ISBN 978-0-12-181801-2.