Se realiza un ensayo nuclear para identificar los genes que se están transcribiendo en un momento determinado. Se aíslan e incuban aproximadamente un millón de núcleos celulares con nucleótidos marcados , y los genes en proceso de transcripción se detectan mediante la hibridación del ARN extraído con sondas específicas de genes en una transferencia . [1] García-Martínez et al. (2004) [2] desarrollaron un protocolo para la levadura S. cerevisiae (Genomic run-on, GRO) que permite calcular las tasas de transcripción (TR) de todos los genes de levadura para estimar la estabilidad del ARNm de todos los ARNm de levadura. [3]
Recientemente se han desarrollado métodos de microarrays alternativos, principalmente PolII RIP-chip: inmunoprecipitación de ARN de la ARN polimerasa II con anticuerpos dirigidos al dominio C-terminal fosforilado e hibridación en un portaobjetos o chip de microarrays (la palabra chip en el nombre proviene de "ChIP-chip" donde se requirió un Affymetrix GeneChip especial). Se ha realizado una comparación de métodos basados en run-on y ChIP-chip en levadura (Pelechano et al., 2009). Se ha detectado una correspondencia general de ambos métodos pero GRO es más sensible y cuantitativo. Debe tenerse en cuenta que el run-on solo detecta ARN polimerasas alargadas, mientras que ChIP-chip detecta todas las ARN polimerasas presentes, incluidas las retrocedidas.
La inclusión de sarkosyl evita la unión de la nueva ARN polimerasa a los genes . Por lo tanto, sólo los genes que ya tienen una ARN polimerasa producirán transcripciones marcadas. Las transcripciones de ARN que se sintetizaron antes de agregar el marcador no se detectarán ya que carecerán del marcador. Estas transcripciones ejecutadas también se pueden detectar purificando transcripciones marcadas mediante el uso de anticuerpos que detectan la etiqueta e hibridando estas transcripciones aisladas con matrices de expresión génica o mediante secuenciación de próxima generación (GRO-Seq). [4]
Los ensayos Run on han sido reemplazados en gran medida por ensayos Global Run on que utilizan la secuenciación de ADN de próxima generación como plataforma de lectura. Estos ensayos se conocen como GRO-Seq y brindan una vista increíblemente detallada de los genes involucrados en la transcripción con niveles cuantitativos de expresión. Los métodos basados en matrices para analizar ensayos de ejecución global (GRO) están siendo reemplazados por la secuenciación de próxima generación, que elimina el diseño de sondas contra secuencias de genes. La secuenciación catalogará todas las transcripciones producidas incluso si no se incluyen en las bases de datos. GRO-seq implica el etiquetado de transcripciones recién sintetizadas con bromuridina (BrU). Las células o núcleos se incuban con BrUTP en presencia de sarkosyl , que impide la unión de la ARN polimerasa al ADN. Por lo tanto, sólo la ARN polimerasa que ya está en el ADN antes de la adición de sarkosyl producirá nuevos transcritos que se marcarán con BrU. Las transcripciones marcadas se capturan con perlas marcadas con anticuerpos anti-BrU, se convierten en ADNc y luego se secuencian mediante secuenciación de ADN de próxima generación. Luego, las lecturas de secuenciación se alinean con el genoma y el número de lecturas por transcripción proporciona una estimación precisa del número de transcripciones sintetizadas. [5]