La cromatografía en columna quiral [1] [2] es una variante de la cromatografía en columna que se emplea para la separación de compuestos quirales, es decir, enantiómeros , en mezclas como racematos o compuestos relacionados. La fase estacionaria quiral (CSP) está formada por un soporte, normalmente a base de sílice, sobre el que se une o inmoviliza un reactivo quiral o una macromolécula con numerosos centros quirales. [3]
La fase estacionaria quiral se puede preparar uniendo un compuesto quiral a la superficie de un soporte aquiral como gel de sílice . Por ejemplo, una clase de fases estacionarias quirales más utilizadas tanto en cromatografía líquida como en cromatografía de fluidos supercríticos se basa en oligosacáridos [4] como la amilosa celulosa o la ciclodextrina (en particular con β-ciclodextrina, una molécula de siete anillos de azúcar) inmovilizadas en gel de sílice.
El principio también se puede aplicar a la fabricación de columnas monolíticas de HPLC [5] o columnas de cromatografía de gases . [6] o columnas de cromatografía de fluidos supercríticos . [7]
La fase estacionaria quiral, CSP, puede interactuar de manera diferente con dos enantiómeros, mediante un proceso conocido como reconocimiento quiral. El reconocimiento quiral depende de diversas interacciones, como enlaces de hidrógeno , interacción π-π , apilamiento de dipolos , complejación de inclusiones , interacciones estéricas, hidrofóbicas y electrostáticas , interacciones de transferencia de carga , interacciones iónicas, etc., entre el analito y el CSP, para formarse in situ. complejos diastereoméricos transitorios.
La mayoría de los tipos de fases estacionarias se pueden clasificar como tipo Pirkle (tipo cepillo), [8] [9] a base de proteínas, [10] a base de ciclodextrinas, [11] carbohidratos a base de polímeros (CSP a base de polisacáridos), [12 ] Antibiótico macrocíclico, [13] Éteres de corona quirales, [14] polímeros impresos, [15] etc.
Las fases estacionarias quirales tipo cepillo, o tipo Pirkle [16] [17], también se denominan columnas donnor-aceptoras π-π. Según algunos modelos teóricos, la separación en estos CSP se basa en una unión de tres puntos entre el soluto y el ligando quiral unido en la superficie de la fase estacionaria. Estas interacciones pueden ser de naturaleza atractiva o repulsiva, dependiendo de las propiedades mutuas. Las columnas Pirkle discriminan enantiómeros mediante la unión de un enantiómero con la fase estacionaria quiral, formando así un complejo diastereomérico mediante enlaces π-π, enlaces de hidrógeno, interacciones estéricas y/o apilamiento de dipolos. Pirkle CSP se puede clasificar en tres clases: [18]
(i) π- aceptor de electrones
(ii) π- donante de electrones
(iii) Donante de electrones π-aceptor de electrones π.
Una fase estacionaria quiral basada en proteínas se basa en gel de sílice, sobre el cual se inmoviliza o se une una proteína. [19] La proteína se basa en muchos centros quirales, por lo tanto, el mecanismo de interacción quiral entre la proteína y los analitos implica muchas interacciones, como interacciones hidrofóbicas y electrostáticas, enlaces de hidrógeno e interacciones de transferencia de carga, que pueden contribuir al reconocimiento quiral. Las interacciones hidrofóbicas entre la proteína y el analito se ven afectadas por el porcentaje orgánico en la fase móvil. A medida que aumenta el contenido orgánico, disminuye la retención en las columnas basadas en proteínas.
El polisacárido natural forma la base de un importante grupo de columnas diseñadas para la separación quiral. Los principales polisacáridos son la celulosa , la amilosa , el quitosano , el dextrano , el xilano , el curdlan y la inulina . [20] La fase estacionaria basada en polisacáridos tiene una alta capacidad de carga, muchos centros quirales y una estereoquímica complicada, y puede usarse para la separación de una amplia gama de compuestos.
Las fases estacionarias quirales basadas en polisacáridos tienen una amplia aplicación debido a su alta eficiencia de separación, selectividad, sensibilidad y reproducibilidad en condiciones normales y de fase reversa, así como su amplia aplicabilidad para compuestos estructuralmente diversificados. [21] El mecanismo de interacción quiral en la fase estacionaria quiral basada en polisacáridos aún no se ha dilucidado. Sin embargo, se cree que las siguientes interacciones desempeñan un papel en la retención: [22]
(i) Interacciones de enlaces de hidrógeno del analito quiral polar con grupos carbamato en el CSP;
(ii) interacciones π-π entre grupos fenilo en el CSP y grupos aromáticos del soluto;
(i) Interacciones dipolo-dipolo
(ii) Interacciones estéricas debido a la estructura helicoidal del CSP.
Estos efectos sobre el proceso de retención se originan también de la funcionalidad de los derivados del polisacárido, su peso molecular promedio y distribución de tamaños, el solvente utilizado para inmovilizarlo sobre el soporte de sílice macroporoso y la naturaleza del soporte de sílice macroporoso en sí.
La fase estacionaria quiral de ciclodextrina (CD) se produce mediante la degradación parcial del almidón por la enzima ciclodextrina glicosiltransferasa , seguida del acoplamiento enzimático de las unidades de glucosa , formando una estructura toroidal. Las CD son oligosacáridos cíclicos que constan de seis (α CD), siete (β CD) y ocho (γ CD) unidades de glucopiranosa . El mecanismo de reconocimiento quiral se basa en una especie de complejación de inclusión . La complejación implica la interacción de la porción hidrofóbica de un enantiómero de analito con el interior no polar de la cavidad, mientras que los grupos funcionales polares pueden formar un enlace de hidrógeno con el espacio de la cavidad quiral del hidroxilo polar. El factor más importante que determina si la molécula de analito encajará en la cavidad de la ciclodextrina es su tamaño. La α-CD consta de 30 centros estéreoselectivos, la β-CD consta de 35 centros estéreoselectivos y la γ-CD consta de 40 centros estéreoselectivos. Cuando la porción hidrófoba del analito es mayor o menor que el tamaño de la cavidad del toroide, no se producirá la inclusión.
Las fases estacionarias quirales macrocíclicas consisten en un soporte de sílice, sobre el cual se unen moléculas de antibióticos macrocíclicos. [13] Los antibióticos macrocíclicos comúnmente utilizados incluyen rifamicina , glicopéptidos (por ejemplo, avoparcina , teicoplanina , ristocetina A, vancomicina y sus análogos), antibiótico polipeptídico tiostreptón y aminoglucósidos (por ejemplo, fradiomicina , kanamicina y estreptomicina ). Los antibióticos macrocíclicos interactúan con el analito a través de enlaces de hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo con los grupos polares del analito, interacciones iónicas e interacciones π-π.
Las fases estacionarias de la corona quiral consisten en éteres de corona, inmovilizados o unidos a las partículas de soporte, son poliéteres con una estructura macrocíclica que puede crear complejos huésped-huésped con iones de metales alcalinos , alcalinotérreos y cationes de amonio . El esqueleto de la estructura cíclica está compuesto por grupos oxígeno y metileno dispuestos alternativamente. Los oxígenos del éter donadores de electrones se encuentran dentro de la pared interna de la cavidad de la corona y están rodeados por grupos metileno en una disposición similar a un collar. El reconocimiento quiral se basa en dos complejos de inclusión diastereoméricos distintos que se pueden generar. Las principales interacciones que facilitan la complejación implican enlaces de hidrógeno, formados entre los tres hidrógenos de la amina y los oxígenos del éter macrocíclico, dispuestos en una configuración de trípode. Además, pueden ocurrir interacciones iónicas, interacciones dipolo-dipolo o enlaces de hidrógeno entre los grupos carbocíclicos y los grupos polares de los analitos, lo que proporciona un soporte adicional para los complejos.
El desarrollo de métodos de cromatografía quiral todavía se realiza mediante la selección de columnas de las distintas clases de columnas quirales. [23] Si bien los mecanismos de separación quiral son comprensibles en ciertos escenarios, y las características de retención de los analitos dentro de las columnas cromatográficas pueden dilucidarse ocasionalmente, la combinación precisa de fases estacionarias quirales (CSP) y composiciones de fase móvil que se requieren para resolver efectivamente un problema específico El par enantiomérico a menudo sigue siendo difícil de alcanzar.
La química de los ligandos de CSP influye significativamente en la creación de complejos diastereoméricos in situ sobre la superficie de la fase estacionaria. Sin embargo, las condiciones de otros métodos, como los disolventes de la fase móvil, su composición, los aditivos de la fase móvil y la temperatura de la columna, pueden desempeñar papeles igualmente críticos. La resolución final de los enantiómeros es el resultado de la combinación de fuerzas intermoleculares, e incluso un cambio sutil en ellas puede determinar el éxito o el fracaso de la separación. Esta complejidad impide establecer protocolos rutinarios de desarrollo de métodos que sean universalmente aplicables a una amplia gama de enantiómeros. De hecho, a veces el resultado de experimentos previos fallidos no proporciona ninguna pista para los pasos siguientes. Por lo tanto, en la práctica, la configuración de un laboratorio de desarrollo de métodos quirales actúa como un protocolo de detección de alto rendimiento, [24] al realizar una detección sistemática de varios CSP mediante dispositivos avanzados de conmutación de columnas, probando automática y sistemáticamente varias combinaciones de fases móviles, empleando eficazmente una estrategia de prueba y error. [23]
Debido al mecanismo de retención altamente complejo de una fase estacionaria quiral debido al reconocimiento quiral, [17] cuyos principios no han sido descifrados, a menudo es difícil, si no imposible, predecir de antemano los pasos que se pueden aplicar con éxito a los enantiómeros. disponibles como parte del desarrollo del método. Es por eso que el enfoque estándar en el desarrollo del método es la detección de alto rendimiento, para evaluar o examinar una serie de fases estacionarias, utilizando varias combinaciones de fases móviles, para aumentar las posibilidades de encontrar una condición de separación adecuada. [23]
Este artículo incorpora texto de Celina Nazareth y Sanelly Pereira disponible bajo licencia CC BY 4.0.