La cromatografía de fluidos supercríticos ( SFC ) [1] es una forma de cromatografía de fase normal que utiliza un fluido supercrítico como el dióxido de carbono como fase móvil. [2] [3] Se utiliza para el análisis y la purificación de moléculas de peso molecular bajo a moderado , térmicamente lábiles y también se puede utilizar para la separación de compuestos quirales . Los principios son similares a los de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC); sin embargo, la SFC normalmente utiliza dióxido de carbono como fase móvil. Por lo tanto, todo el camino del flujo cromatográfico debe estar presurizado. Debido a que la fase supercrítica representa un estado en el que convergen las propiedades del líquido y el gas a granel, la cromatografía de fluidos supercríticos a veces se denomina cromatografía de convergencia. [4] La idea de la convergencia de las propiedades del líquido y el gas fue concebida por primera vez por Giddings. [5]
La SFC se ha utilizado principalmente para la separación de moléculas quirales , principalmente aquellas que requieren condiciones de fase normal . Mientras que la fase móvil es un fluido en estado supercrítico, la fase estacionaria se empaqueta dentro de columnas similares a las que se utilizan en la cromatografía líquida. Dado que el uso del modo de fase normal de cromatografía siguió siendo menos común, también lo fue la SFC; por lo tanto, ahora se utiliza comúnmente para separaciones y purificaciones quirales y aquirales seleccionadas en la industria farmacéutica . [6] [7]
Instrumentación de cromatografía de fluidos supercríticos [8] La cromatografía de fluidos supercríticos tiene una configuración similar a la de un instrumento HPLC. Las fases estacionarias son similares y están empaquetadas dentro de tipos de columnas similares. Sin embargo, estos sistemas tienen características especiales debido a la necesidad de mantener la fase móvil en un estado fluídico supercrítico en todo el sistema. La temperatura es fundamental para mantener los fluidos en un estado supercrítico, por lo que debe haber una herramienta de control de calor en el sistema, similar a la de la cromatografía de gases. Además, debe haber un mecanismo de control de presión preciso, un limitador para mantener la presión por encima de un cierto punto, porque la presión es otro parámetro esencial para mantener la fase móvil en un estado de fluido supercrítico, de modo que se mantenga en el nivel mínimo requerido. Se coloca un mecanismo de microprocesador en el instrumento para la cromatografía de fluidos supercríticos. Esta unidad recopila datos de presión, temperatura del horno y rendimiento del detector para controlar las piezas relacionadas del instrumento.
El CO2 se utiliza en bombas dedicadas al dióxido de carbono, que requieren que el CO2 entrante y los cabezales de la bomba se mantengan fríos, a fin de mantener el dióxido de carbono a una temperatura y presión adecuadas para el estado fluídico supercrítico, donde se puede medir de manera efectiva en un rango de caudal especificado. Posteriormente, el CO2 se convierte en fluido supercrítico en todo el inyector y el horno de columna, cuando la temperatura y la presión a las que está sometido se elevan por encima del punto crítico del líquido, por lo que se logra el estado supercrítico.
Los fluidos supercríticos combinan propiedades útiles de las fases gaseosa y líquida, ya que pueden comportarse tanto como un gas como como un líquido en varios aspectos. Un fluido supercrítico proporciona una característica similar a la de un gas cuando llena un recipiente y toma la forma del recipiente. El movimiento y la cinética de las moléculas son bastante similares a las moléculas de gas. Por otro lado, un fluido supercrítico se comporta como un líquido porque su propiedad de densidad es cercana a la del líquido; por lo tanto, un fluido supercrítico muestra una similitud con el efecto disolvente de un líquido. El resultado es que se pueden cargar masas, similares a las utilizadas en HPLC, en la columna por inyección, y aún así mantener una alta eficiencia cromatográfica similar a las logradas en GC. Por lo general, se emplea la elución en gradiente en SFC analítico utilizando un cosolvente polar como metanol, posiblemente con un ácido o base débil a bajas concentraciones ~1%. Se puede observar que el recuento aparente de placas por análisis supera las 500K placas por metro de manera rutinaria con fases estacionarias de 5 um. El operador utiliza un software para configurar el caudal de la fase móvil, la composición del codisolvente, la contrapresión del sistema y la temperatura del horno de la columna, que debe superar los 40 °C para lograr las condiciones supercríticas necesarias con CO2 . Además, el SFC proporciona un parámetro de control adicional (presión) mediante el uso de un regulador de contrapresión estático y dinámico automatizado. Desde un punto de vista operativo, el SFC es tan simple y robusto como el HPLC , pero la recolección de fracciones es más conveniente porque la fase móvil primaria se evapora dejando solo el analito y un pequeño volumen de codisolvente polar. Si se captura el CO2 de salida , se puede volver a comprimir y reciclar, lo que permite una reutilización de >90% del CO2 .
Similar a la HPLC, la SFC utiliza una variedad de métodos de detección que incluyen UV /VIS, espectrometría de masas , FID (a diferencia de la HPLC) y dispersión de luz evaporativa.
Una regla general es que cualquier molécula que se disuelva en metanol o en un disolvente menos polar es compatible con la SFC, incluidos los solutos polares no volátiles. El CO2 tiene una polaridad similar al n-heptano [9] en su punto crítico. La fuerza de elución del disolvente se puede aumentar simplemente aumentando la densidad o, alternativamente, utilizando un codisolvente polar. En la práctica, cuando la fracción del codisolvente es alta, la fase móvil podría no estar realmente en estado de fluido supercrítico, pero esta terminología se utiliza de todos modos y los cromatogramas muestran una mejor elución y una mayor eficiencia de todos modos.
La fase móvil está compuesta principalmente de dióxido de carbono supercrítico , pero como el CO2 por sí solo es demasiado no polar para eluir eficazmente muchos analitos, se añaden codisolventes para modificar la polaridad de la fase móvil. Los codisolventes suelen ser alcoholes simples como metanol , etanol o alcohol isopropílico . Se pueden utilizar otros disolventes como acetonitrilo , cloroformo o acetato de etilo como modificadores. Para materiales de grado alimenticio, el codisolvente seleccionado suele ser etanol o acetato de etilo, ambos generalmente reconocidos como seguros ( GRAS ). Las limitaciones de los disolventes se basan en el sistema y la columna.
En el pasado, ha habido algunos problemas técnicos que han limitado la adopción de la tecnología SFC. En primer lugar, está la necesidad de mantener una alta presión de gas en las condiciones de funcionamiento. Los recipientes de alta presión son caros y voluminosos, y a menudo se necesitan materiales especiales para evitar que las juntas y los anillos tóricos se disuelvan en el fluido supercrítico. Un segundo inconveniente es la dificultad de mantener la presión constante (mediante la regulación de la contrapresión). Mientras que los líquidos son casi incompresibles, por lo que sus densidades son constantes independientemente de la presión, los fluidos supercríticos son altamente compresibles y sus propiedades físicas cambian con la presión, como la caída de presión a través de una columna de lecho empacado. Actualmente, los reguladores de contrapresión automatizados pueden mantener una presión constante en la columna incluso si varía el caudal, lo que mitiga este problema. Un tercer inconveniente es la dificultad en la separación de gas/líquido durante la recolección del producto. Tras la despresurización, el CO2 se convierte rápidamente en gas y aerosoliza cualquier analito disuelto en el proceso. Los separadores ciclónicos han reducido las dificultades en las separaciones de gas/líquido.