Jay Dunlap es un cronobiólogo y fotobiólogo estadounidense que ha hecho importantes contribuciones al campo de la cronobiología al investigar los mecanismos subyacentes de los sistemas circadianos en Neurospora , un hongo comúnmente utilizado como organismo modelo en biología, y en modelos de cultivo de células de ratones y mamíferos. Las principales contribuciones de Jay Dunlap incluyen su trabajo investigando el papel de los genes del reloj frq y wc en la ritmicidad circadiana, y su liderazgo en la coordinación de la colección de knockout de todo el genoma para Neurospora . Actualmente es el Profesor Nathan Smith de Biología Molecular y de Sistemas en la Escuela de Medicina Geisel en Dartmouth . Él y su colega Jennifer Loros han sido mentores de numerosos estudiantes y becarios postdoctorales, muchos de los cuales actualmente ocupan puestos en varias instituciones académicas.
Nacido en Ludlow, Massachusetts, el 9 de mayo de 1952, Jay Dunlap creció en York, Pensilvania, como el tercero de cuatro hijos. [1] Dunlap se interesó en la oceanografía bioquímica durante un programa de verano de la escuela secundaria y decidió seguir este interés en la universidad. Se graduó con una licenciatura en oceanografía y una licenciatura en química de la Universidad de Washington en 1974. [1]
Dunlap originalmente planeó estudiar oceanografía en sus estudios de posgrado. Sin embargo, después de reunirse con John Woodland Hastings , quien estudió la regulación circadiana de la bioluminiscencia en organismos marinos, Dunlap decidió estudiar biología en la escuela de posgrado en la Universidad de Harvard . Mientras estudiaba con Hastings , Dunlap cambió su campo de estudio a la biología circadiana . [1] [2]
Para su beca postdoctoral, Dunlap asistió a la Universidad de California, Santa Cruz y comenzó a trabajar con Jerry Feldman, quien había aislado con éxito mutantes del gen del reloj en Neurospora que tienen períodos de oscilación circadiana anormalmente largos o cortos . Dunlap no pudo clonar la frecuencia , un gen que tiene un papel importante en el ciclo de retroalimentación negativa de transcripción-traducción (TTFL) que impulsa los ritmos circadianos en Neurospora , ya que el laboratorio de Santa Cruz no tenía las herramientas moleculares necesarias para estudiar la biología molecular de Neurospora en profundidad. [3] Dunlap aprendió técnicas moleculares básicas mientras trabajaba junto con otros estudiantes de posgrado de biología en otros laboratorios. En un momento, Dunlap trabajó con Harry F. Noller , un reconocido bioquímico cuyo laboratorio había "adoptado extraoficialmente" a Dunlap. [3]
En 1984, Dunlap consiguió un puesto de profesor adjunto en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina Geisel de Dartmouth . Se convirtió en profesor de Bioquímica en 1994 antes de ser nombrado presidente inaugural del Departamento de Genética en 1999. En 2010, Dunlap fue nombrado profesor Nathan Smith y, en 2016, fue designado presidente inaugural del Departamento de Biología Molecular y de Sistemas, que incluía Genética y otros departamentos. [4]
En estrecha colaboración con el laboratorio de Jennifer Loros , la investigación de Dunlap se ha centrado principalmente en la base molecular de los ritmos circadianos utilizando Neurospora como sistema modelo para comprender mejor el reloj circadiano de los mamíferos. Aunque también se identificaron mutaciones del gen del reloj en Drosophila y Chlamydomonas , [1] Dunlap estudió Neurospora en su trabajo postdoctoral, ya que en ese momento se podía aplicar una gama más amplia de herramientas bioquímicas y genéticas a la especie. [3] Neurospora era un organismo modelo simple y una herramienta poderosa para estudiar la genética molecular; su reloj molecular, entonces desconocido, presentaba una gran oportunidad para la exploración. [4]
Basándose en el trabajo de Dunlap y otros, ahora se entiende que los genes del reloj codifican proteínas que participan en un ciclo de retroalimentación negativa automantenida : los activadores transcripcionales impulsan la expresión de ARNm de genes del reloj específicos , que se traducen en proteínas del reloj, que entran en el núcleo y actúan para deprimir la actividad de los activadores transcripcionales que impulsan la expresión de los genes del reloj. [5] Sin embargo, los genes del reloj aún no estaban clonados cuando Dunlap comenzó su investigación como profesor asistente en 1984. Dunlap predijo correctamente que las células individuales, incluidas las células de los mamíferos, pueden actuar como osciladores autónomos con sus propios ritmos circadianos intrínsecos. [6]
Dunlap descifró el sistema circadiano al plantear y abordar tres problemas del metabolismo celular:
Antes de la adopción de reporteros transcripcionales como la luciferasa , los estudios del reloj circadiano de Neurospora utilizaban el desarrollo rítmico de esporas asexuales (conidios) , ensayadas usando un tubo de carreras. [7] La producción de conidios alcanza su punto máximo en la noche subjetiva, un fenotipo conductual que falta en cepas arrítmicas. Durante su trabajo de posgrado, Jennifer Loros observó al mutante frq 9 como un alelo recesivo, arrítmico y fenotípicamente nulo en el gen frq . [8] Su observación, combinada con la capacidad de transformar Neurospora con ADN exógeno , proporcionó la base para una nueva estrategia para clonar frq , es decir, mediante el rescate basado en la transformación del fenotipo conductual del mutante nulo. Utilizando un paseo cromosómico bidireccional que comienza en oli , un gen en el mismo grupo de ligamiento que frq , Dunlap y sus colegas caminaron más de 200 kb a través de frq . [3] La ubicación de frq se verificó en 1986 a través de la transformación de cósmidos en frq 9 y rescatando el ritmo circadiano. frq fue así el segundo gen del reloj en ser clonado, después de Drosophila per . Además, el laboratorio secuenció manualmente aproximadamente 9kb y realizó un mapeo de transcripción en la región genómica frq ; los resultados se publicaron en Nature en 1989. [3] En un trabajo posterior, Dunlap y colegas demostraron que frq se expresaba rítmicamente y pudieron manipular la expresión de frq lo suficiente como para crear un mutante nulo . Implementaron un sistema en el que un promotor heterólogo , inducido de una manera que no afectara al reloj, podía usarse para impulsar la expresión regulada de frq . Usando este sistema, demostraron que el producto de frq actuaba para reprimir su propia síntesis; era autorregulador . Dunlap y sus colegas observaron que la sobreexpresión continua de frq daba lugar a arritmicidad y definieron la fase del ritmo del reloj como el momento en el que la célula volvía a los niveles normales de expresión de frq . Llegaron a la conclusión, en un artículo de Science en 1994, de que el marcapasos central delEl reloj de Neurospora está regulado a través de retroalimentación negativa por proteínas de reloj, y frq determina su propia expresión a través de la autorregulación mediante retroalimentación negativa, lo que demuestra que la retroalimentación negativa autorreguladora intracelular es la base de un oscilador circadiano. [9] [10]
El trabajo de Dunlap sobre el mecanismo de autorregulación incluyó modelar el ciclo de retroalimentación negativa del reloj circadiano y descubrir los roles y conexiones entre activadores (que identificó como proteínas con dominios PAS ) y represores (productos de los genes del reloj). [11] Además, Dunlap demostró el rol de la fosforilación de proteínas en el mecanismo del reloj y ha realizado investigaciones que involucran el rol de estas proteínas (a saber, Casein Kinase 2 ) en el mecanismo de compensación de temperatura. En 2009, Dunlap y colegas demostraron que la proteína FRQ está fosforilada en más de 100 sitios de una manera altamente reproducible y específica para la hora del día [12] y que la caseína quinasa 2 establece y mantiene la compensación de temperatura dentro del reloj circadiano. [13] Cuatro años después, en 2013, Dunlap y colegas encontraron que FRQ es una proteína intrínsecamente desordenada cuya estabilidad está determinada por su interacción con la proteína asociada FRH. Además, Dunlap y sus colegas descubrieron que la fosforilación diaria de FRQ regula su capacidad de interactuar con las proteínas en el complejo de elementos negativos. [14] Dunlap descubrió que la cinética de estos procesos circadianos está fuertemente influenciada por la fosforilación progresiva de FRQ. [15]
Después de identificar a frq como un gen de reloj cuya abundancia de productos tiende a ser variable y rítmica, Dunlap, Loros y sus colegas demostraron cómo la regulación ambiental de su expresión condujo a la comprensión de la base molecular del arrastre circadiano por la luz: a través de la inducción de la expresión de frq por la luz. [16]
En 1995, Loros y Dunlap trabajaron para descubrir la base molecular subyacente a cómo la luz reinicia el reloj, un mecanismo que más tarde se demostró en un trabajo colaborativo con Hitoshi Okamura que se conserva en los mamíferos. [17] El ciclo diario en los niveles de transcripción de frq , combinado con la capacidad de la luz para inducir de forma aguda la expresión de frq , explicó el restablecimiento de la luz (los avances y retrasos observados en una curva de respuesta de fase ). Si se proporcionaba luz e inducía frq -ARNm cuando estaba aumentando a niveles máximos (noche subjetiva tardía), la luz llevaría rápidamente los niveles de frq -ARNm a valores máximos, lo que daría como resultado un avance. Si la luz inducía frq -ARNm mientras sus niveles estaban cayendo (noche subjetiva temprana), frq -ARNm volvería rápidamente a los niveles máximos causando un retraso de fase. Los resultados de esta investigación llevaron a la conclusión de que la inducción de frq por la luz es responsable de los avances y retrasos específicos de fase observados en Neurospora y proporcionaron una explicación general de cómo la respuesta unidireccional de un componente del reloj a una señal ambiental (luz) podría resultar en una respuesta de reloj bidireccional específica de la hora del día (avances o retrasos): la base del arrastre circadiano. [2] Estos experimentos eventualmente llevaron al reconocimiento universal del arrastre a través de cambios inducidos por la luz en una variable específica del oscilador circadiano, observados posteriormente en Drosophila y mamíferos.
El mecanismo a través del cual la luz induce frq era desconocido en el momento en que se explicó el arrastre, y los estudios destinados a identificar las proteínas responsables de la inducción de frq por la luz llevaron a la identificación de White Collar-1 y White Collar-2 como componentes del complejo activador circadiano. [18] El trabajo de Giuseppe Macino había demostrado que White Collar-1 se asocia a través de dominios PAS con White Collar-2 para crear el complejo White Collar; Dunlap, Loros y colegas demostraron cómo este complejo heterodimérico es el factor de transcripción que actúa en la oscuridad para impulsar la expresión de frq , actuando así como el activador en el ciclo de retroalimentación negativa circadiana. Esta observación asoció actividades bioquímicas específicas, unión de ADN y activación transcripcional, con proteínas de reloj conocidas, lo que permitió la formulación del oscilador como un ciclo de retroalimentación negativa de transcripción-traducción de un solo paso. [18] Más tarde, en 1997, se demostró que el primer gen del reloj de los mamíferos ( CLOCK ) codificaba una proteína que tenía dominios PAS de manera similar y, más tarde, se asociaba a través de dominios PAS con una proteína diferente, BMAL1, formando nuevamente un complejo proteico heterodimérico que actuaba como activador transcripcional; se identificaron proteínas similares en 1998 en Drosophila . Esto confirmó un modelo común para los bucles de retroalimentación negativa de transcripción-traducción en hongos y animales: un elemento positivo compuesto por dos proteínas diferentes que interactúan a través de dominios PAS impulsa la expresión de elementos negativos como FRQ o PER que, en asociación con otras proteínas, reprimen la actividad de los activadores heterodiméricos: retroalimentación negativa. [19] Estas observaciones contribuyeron a que Circadian Rhythms fuera nombrado primer finalista de Breakthrough of the Year en la revista Science en 1997.
Aunque se estableció que el factor de transcripción heterodímero WC-1 / WC-2 era necesario para la inducción de frq por la luz , los investigadores creían que WC-1 y WC-2 no tenían un papel directo en el proceso de fotorrecepción . En cambio, se asumió que el factor de transcripción WC-1 / WC-2 era el objetivo final de una cascada de transducción de señales iniciada por la acción de la luz sobre un fotorreceptor de luz azul distinto . En 2002, Dunlap y sus colegas estudiaron bioquímicamente WC-1 / WC-2 in vitro para demostrar que WC-1 se unía a FAD como cofactor (también demostrado de forma independiente por Yi Liu), y el análisis de la unión al ADN por el complejo WC-1 / WC-2 mostró que la luz resultó en un cambio estructural en el heterodímero. La respuesta a la dosis y el espectro de acción para este cambio estructural in vitro en WC-1 dependían de FAD y coincidían con la respuesta a la dosis in vivo y el espectro de acción para la supresión de la luz de las bandas circadianas determinadas por Briggs y colegas en 1967. Estos hallazgos revelaron que WC-1 es un fotorreceptor de luz azul y un fotorreceptor circadiano; la cascada de transducción de señales del fotorreceptor al factor de transcripción ocurre todo dentro de la misma proteína. [21] [15] WC-1 es el miembro fundador de la familia de fotorreceptores de luz azul común a todos los hongos . [22] Los fotorreceptores circadianos se identificaron más tarde en animales y plantas verdes y se demostró que eran distintos de WC-1 .
En 1989, el trabajo de Dunlap con Jennifer Loros condujo a la primera detección dirigida de genes regulados por el reloj circadiano, allanando el camino para la disección sistemática de las vías de salida del reloj. [23] El término "genes controlados por el reloj" (CCG) fue acuñado en este estudio. Los CCG se definen como genes cuyo nivel de expresión está regulado por el reloj circadiano pero cuyas actividades no afectan el funcionamiento del reloj. Ahora se cree ampliamente que el control circadiano de la expresión genética es el principal medio a través del cual los relojes controlan la biología de las células en las que operan. El trabajo posterior amplió el universo de CCG en Neurospora , y más tarde en células de mamíferos , [24] y reveló la conexión entre los ciclos circadianos y celulares en los que el reloj regula la respuesta al daño del ADN que, a su vez, puede regular el reloj. [25] La búsqueda de CCG finalmente culminó en la descripción completa del transcriptoma circadiano de Neurospora donde hasta el 40% del genoma está controlado diariamente por el reloj. [26]
El trabajo de posgrado de Jay Dunlap en Harvard con JW Hastings se centró en la bioluminiscencia en el organismo marino Gonyaulax . Su trabajo descubrió la estructura de la luciferina de Gonyaulax . Después de purificar la luciferasa , determinaron que se regulaba a través de la síntesis y destrucción diarias. [3] Esta fue una de las primeras enzimas reguladas por el reloj cuyo método de regulación se determinó en condiciones experimentales. Una parte del mecanismo es que Gonyaulax produce luciferina y luciferasa por la noche cuando se puede ver la luz emitida, mientras que la producción del sustrato y la proteína disminuye al amanecer. La comprensión de que una comprensión completa de este proceso bioquímico también requeriría un enfoque genético combinado llevó a Dunlap a comenzar su estudio del reloj circadiano de Neurospora . [2]
Dunlap y sus colegas desarrollaron posteriormente la bioluminiscencia como un indicador de la expresión génica en Neurospora . Antes del uso de la bioluminiscencia , el único ensayo de ritmicidad en Neurospora era el ciclo diario en el desarrollo asexual ( conidiación ). Como resultado, las cepas que portaban mutaciones que interferían con el desarrollo no podían analizarse con precisión en cuanto a ritmicidad. Dunlap, junto con Jennifer Loros , Arun Mehra y Van Gooch, adaptaron la luciferasa de luciérnaga para su expresión en Neurospora , ampliando así en gran medida la capacidad de analizar cepas. [7] La luciferasa impulsada por el promotor frq es un indicador exquisitamente sensible para el oscilador central y se ha utilizado para demostrar que los ritmos de desarrollo que no requieren frq no son verdaderamente circadianos , [27] y que la fosforilación diaria de la proteína FRQ, pero no el recambio diario de la proteína FRQ, es necesaria para cerrar el ciclo de retroalimentación negativa . [28] El nuevo método utilizado por Dunlap y sus colegas para caracterizar y utilizar el gen de la luciferasa mejoró la expresión en 3 órdenes logarítmicos y permitió la corrección de varios errores en la literatura sobre Neurospora . Dunlap y Loros colaboraron con Cassius Stevani para demostrar que la bioluminiscencia del basidiomiceto (hongo) Neonothopanus gardneri está regulada por ritmos circadianos a través de la expresión regulada de la luciferasa , la luciferina y una reductasa requerida . [29] N. gardneri se encuentra creciendo debajo de las palmeras en el bosque amazónico y se cree que el hongo utiliza la bioluminiscencia nocturna para atraer insectos por la noche como una ayuda para la dispersión de esporas. [30]
Dunlap y sus colegas han contribuido en gran medida a los avances en el uso de la tecnología en el campo de la biología molecular . Estos avances metodológicos han tenido importantes implicaciones tanto para la biología fúngica como para la cronobiología y sus direcciones futuras. Por ejemplo, el laboratorio de Dunlap desarrolló el primer reemplazo genético para Neurospora en 1991. Estas tecnologías, así como el apoyo de Dunlap, contribuyeron en gran medida a la secuenciación del genoma de Neurospora (que se logró en 2002). Posteriormente, Dunlap y su equipo mejoraron los reemplazos genéticos. Encabezó el esfuerzo para eliminar los 10.000 genes del genoma de Neurospora y la construcción de un mapa de polimorfismos de un solo nucleótido de alta densidad . Finalmente, Dunlap revolucionó el papel de la expresión de la luciferasa al examinar el sesgo de codones y está utilizando sus implicaciones en Neurospora y otros organismos. [7]
Dunlap continúa investigando el reloj circadiano, utilizando Neurospora y otros organismos, como Aspergillus fumigatus . [31] Como resultado del Proyecto Genoma de Neurospora crassa , [32] cuyos resultados se publicaron en 2003, y el desarrollo de knockouts para cada gen, que se almacenan en el Fungal Genetics Stock Center , Dunlap cree que la base molecular del reloj circadiano de Neurospora puede ser la primera en ser completamente entendida. Debido a la naturaleza altamente conservada de los relojes biológicos, los mecanismos del reloj han evolucionado relativamente pocas veces y son similares entre especies. El conocimiento de los sistemas de Neurospora puede conducir a aplicaciones con relevancia para la salud humana. La naturaleza circadiana de los procesos celulares en humanos puede aprovecharse para atacar a las células cancerosas de manera más efectiva y tratar las anomalías del sueño.
Dunlap también está interesado en la interacción entre los relojes biológicos y los procesos metabólicos. Si bien los ritmos circadianos rigen aspectos del metabolismo, los productos metabólicos pueden retroalimentar el reloj interno de un organismo. [33] Esta forma de comunicación puede resultar una característica adaptativa de los relojes biológicos y permitir respuestas beneficiosas a los cambios en el entorno. Además, Dunlap trabaja con William Cannon y Jennifer Hurley para desarrollar modelos matemáticos que describan la función del reloj circadiano. Este esfuerzo hará uso de técnicas estadísticas para modelar tanto las reacciones que ocurren en el metabolismo como el reloj en general.
Dunlap también ha estado involucrado en el trabajo que examina la red jerárquica de factores de transcripción que gobiernan la salida circadiana. El oscilador central genera actividad rítmica del activador circadiano heterodímero ( WC-1 / WC-2 o CLOCK/BMAL1), pero la actividad máxima está restringida a un momento del día. Por lo tanto, en Neurospora , el oscilador central que genera el tiempo crea una actividad rítmica del heterodímero WC-1 / WC-2 que alcanza su punto máximo en la mañana. WC-1 / WC-2 se encuentra en la parte superior de una red de factores de transcripción donde diferentes niveles de reguladores trabajan juntos para actuar como un filtro dinámico para la información del tiempo, cambiando la actividad máxima matutina de WC-1 / WC-2 en una señal que puede impulsar la expresión génica circadiana en todo momento del día. Una parte de esto es el factor de transcripción ADV-1. [34] Este factor , que se encuentra en Neurospora , responde a la luz y regula los genes involucrados en procesos como el crecimiento celular .
Recientemente, Dunlap investigó la conservación evolutiva del reloj circadiano entre especies. En concreto, descubrió que las proteínas conservadas en los mecanismos del reloj biológico entre tres especies ( Drosophila melanogaster , Neurospora crassa y Mus musculus ) presentan todas ellas altas cantidades de desorden proteico intrínseco. Las proteínas intrínsecamente desordenadas no tienen una estructura secundaria estable. A lo largo del día, estas proteínas presentan diferentes niveles de desorden. Los niveles cambiantes de desorden permiten un ritmo circadiano estable . Dunlap concluyó que, dado que las proteínas desordenadas están tan conservadas entre diferentes especies, las proteínas deben ser esenciales para el control de los ritmos circadianos en todas ellas. [35]
En su trabajo más reciente, el laboratorio de Dunlap examinó los reguladores de los ARNm que codifican la proteína caseína quinasa 1; uno de estos reguladores es una proteína de unión al ARN traducida del gen prd-2 . Examinaron dos mutaciones (creadas por la inversión de una parte del gen prd-2 ) y descubrieron que estas mutaciones afectaban drásticamente los niveles de caseína quinasa . Estas mutaciones causaban períodos circadianos mucho mayores de 24 horas. Él y sus colegas aumentaron genéticamente los niveles de caseína quinasa 1 y descubrieron que el período se restablecía cuando los niveles de caseína quinasa 1 aumentaban. Concluyeron que el período circadiano depende de los niveles de caseína quinasa 1. [36]
Durante la estancia de Dunlap en Santa Cruz , una de las estudiantes de posgrado de biología que conoció fue Jennifer Loros . Forjaron una relación permanente y se casaron el 1 de septiembre de 1984. Tienen dos hijos. Cuando no está realizando investigaciones, a Dunlap le gusta la jardinería. [3]
Jay Dunlap actualmente está involucrado con las siguientes organizaciones:
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