El gen white collar- -2 ( wc- 2) en Neurospora crassa codifica la proteína White Collar-2 (WC-2). WC-2 es un factor de transcripción GATA necesario para la fotorrecepción de la luz azul y para regular los ritmos circadianos en Neurospora . En ambos contextos, WC-2 se une a su contraparte no redundante White Collar-1 (WC-1) a través de dominios PAS para formar el White Collar Complex (WCC), un factor de transcripción activo . [1]
El CMI desempeña dos funciones principales y distintas en la célula. A la luz, el WCC actúa como un fotorreceptor para mediar la regulación aguda de genes inducidos por la luz implicados en diversos procesos fisiológicos, como la biosíntesis y la conidiación de carotenoides (tipo de pigmento) . [1] En un papel separado y distinto en la oscuridad, WCC actúa como el elemento positivo en el circuito de retroalimentación negativa de transcripción-traducción autorreguladora que controla los comportamientos rítmicos circadianos en Neurospora . En este contexto, WCC regula la expresión del gen Frecuencia (FRQ) , una proteína de reloj inducida por la luz. [2] [3]
En 1959, Pittendrigh et al. Descubrió ritmos biológicos en el desarrollo de esporas asexuales en Neurospora . Experimentos posteriores revelaron que el período intrínseco de Neurospora era de 22 horas a 25°C y estaba compensado por la temperatura. También se encontró que el período estaba compensado nutricionalmente y el pH. Desde entonces, Neurospora se ha convertido en un organismo modelo para estudiar los relojes y ritmos circadianos. [4]
WC-1 se descubrió por primera vez a partir de un mutante wc-1 que inhibía la biosíntesis de carotenoides en micelios pero no en conidios . Los conidios producen carotenoides de forma constitutiva y no requieren regulación por la luz, a diferencia de los micelios que requieren inducción de luz. [5] Este mutante creó un fenotipo en el que estas cepas de Neurospora desarrollaron conidios con pigmentación, pero sin pigmentación en el micelio. Luego, los conidios aparecieron como si tuvieran un borde no pigmentado (o collar blanco) de micelio alrededor de los conidios. WC-2 se descubrió más tarde cuando un segundo mutante causó el mismo fenotipo que el mutante wc-1 . [6] En 1982, Perkins et al. mapearon todos los loci genéticos de Neurospora crassa y localizaron el gen wc-2 . [7]
WC-2 es una proteína nuclear (56.895 Da) compuesta por 530 aminoácidos (aa). [8]
WC-2 tiene un motivo de unión al ADN con dedo de zinc (ZnF) de la familia GATA que permite que el WCC se una a elementos promotores de genes inducidos por la luz como frq . Se ha demostrado que la región ZnF de WC-2 es muy similar a la de WC-1 . Si bien WC-2 y WC-1 tienen una coincidencia de identidad del 26 % (47,5 % de similitud en la secuencia), estas regiones/dominios funcionales tienen coincidencias de identidad aún mayores, que oscilan entre el 33 y el 62 %. [9] WC-2 también posee un dominio PAS que permite interacciones proteína-proteína. WC-2 y WC-1 se heterodimerizan utilizando dominios PAS homólogos para formar el WCC in vivo. [10]
El WCC se une a diferentes tipos de elementos del ADN. En el promotor del gen frq , hay dos regiones que pueden estar unidas por el WCC: una región distal que confiere regulación circadiana a frq que se conoce como Clock Box y un sitio cerca del sitio de inicio de la transcripción que confiere regulación de la luz, conocido como Región Reguladora de Luz Proximal, o PLRE. Tanto Clock Box como PLRE participan en lograr la máxima inducción de luz, y Clock Box es esencial para mantener la ritmicidad en la oscuridad. [4] Solo se requiere la región ZnF de WC-2 para unirse al PLRE, mientras que las regiones ZnF de WC-1 y WC-2 son necesarias para vincularse a Clock Box. [3]
Se ha demostrado que WC-2 es necesario para la expresión de frq tanto impulsada por reloj como por luz . La expresión de frq impulsada por la luz depende de la luz como entrada, ocurre durante el día y está mediada por PLRE. La expresión impulsada por el reloj ocurre en condiciones de oscuridad durante la noche y está mediada por una región separada del promotor frq , Clock Box. Antes de las inactivaciones genéticas definitivas para WC-1 y WC- 2, había cierta confusión en la literatura debido al uso de alelos que se pensaba que eran mutantes nulos pero que en realidad conservaban su función (por ejemplo, el supuesto alelo nulo ER33 de WC-2). Sin embargo, los alelos nulos definitivos de wc-1 o wc-2 son completamente fotociegos y arrítmicos. [11] [12]
Los experimentos han demostrado que la mutación parcial de la región WC-2 ZnF conduce a una inducción parcial de la expresión de frq , mientras que la eliminación completa de la región ZnF no conduce a ninguna expresión. Los mutantes WC-2 con secuencias de ZnF alteradas no lograron unirse al promotor frq a través de Clock Box, un elemento promotor del ADN. Esto provoca que tanto la expresión de FRQ como la actividad de unión al ADN se vean significativamente afectadas. Por lo tanto, estas regiones ZnF son esenciales para la expresión de FRQ en condiciones de luz y para la función circadiana del WCC. [12]
WC-2 juega un papel vital en el mantenimiento de la ritmicidad del marcapasos circadiano en los hongos . Los mutantes nulos wc-2 impiden la expresión adecuada de frq y causan arritmicidad dentro del organismo. Los alelos wc-2 con pérdida parcial de función alteran la compensación de la temperatura, una propiedad intrínseca del reloj, y alargan el período de Neurospora a medida que aumenta la temperatura . [11] Si bien WC-1 siempre se puede encontrar en la región promotora de frq , WC-2 ingresa a la región promotora para formar WCC y aumentar la expresión de frq. Luego, WC-2 se disocia una vez que se ha completado la transcripción de frq. [13] Se cree que CK1 y CK2 son quinasas que fosforilan el WCC y reducen la unión de WC-2 después de la promoción desde FRQ durante la mitad del día subjetivo. Esto se determinó mediante experimentos que redujeron o extinguieron la actividad de CK1 y/o CK2 que mostraron niveles aumentados de unión de WCC al promotor frq. [4]
Se cree que WC-1 y WC-2 son los únicos genes no redundantes y no esenciales que participan en la regulación positiva de los mecanismos inducidos por la luz en Neurospora crassa . WC-1 y WC-2 son análogas a las proteínas Bmal y Clock en los sistemas circadianos de Mouse y Drosophila en sus funciones positivas en los bucles circadianos. [3] [14]
Las cepas con deleción WC-1 y WC-2 muestran evidencia de otras vías de entrada de luz, pero aún no se han identificado. [13]
WC-1 y WC-2 se unen para formar el White Collar Complex (WCC) en cultivos mantenidos tanto en luz como en oscuridad. De las dos proteínas, es la WC-1 la que realmente percibe la luz. WC-1 es un fotorreceptor que se une al dinucleótido de flavina adenina (FAD) como cofactor en un dominio PAS especializado conocido como dominio LOV . FAD absorbe la luz azul e inicia el cambio conformacional en WC-1 que conduce a la respuesta del organismo a la luz. Después de la exposición a la luz, un residuo de cisteína en el bolsillo de unión de FAD de WC-1 se une covalentemente a FAD, lo que hace que FAD cambie su compañero de enlace de hidrógeno . Esto conduce a otros cambios estructurales dentro de WC-1 que eventualmente conducen a la liberación de una hélice alfa en la superficie de WC-1, exponiendo un dominio de interacción proteína-proteína. Entonces se supone que los factores de transcripción generales iniciarán la expresión genética, aunque actualmente se desconoce el mecanismo exacto de esta interacción. [13] Sin embargo, el WCC impulsa la expresión del gen frq y otros genes dependientes de la luz. WC-1 siempre se encuentra en el promotor frq, por lo que la promoción depende de la unión de WC-2. [4] El mecanismo general de interacción entre WC-1 y WC-2 se ha determinado observando genes similares con dominios LOV, como VVD (Vivid), otro sensor de luz azul utilizado para la fotoadaptación. Vivid responde a los cambios en la intensidad de la luz y puede silenciar la expresión de genes relacionados con WC. [13]
En condiciones de luz, WCC adopta la conformación L-WCC, un heterotrímero que consta de dos WC-1 y un WC-2. En condiciones de oscuridad, el WCC adopta una conformación heterodímera (D-WCC) que consta de WC-1 y WC-2. [1]
Como se describió anteriormente, el WCC se une al promotor del gen frq de manera cíclica debido a la fosforilación del WCC que reduce los niveles de unión de WC-2 al promotor cuando se fosforila. El nivel más bajo de unión de WC-2 se produce a mitad del día subjetivo. [4]
Se están realizando más investigaciones para dilucidar el mecanismo de interacción entre WC-2 y otros factores de transcripción, así como para describir detalladamente la interacción con WC-1 para formar el complejo de cuello blanco. Los laboratorios Dunlap y Loros están realizando más trabajos para comprender completamente el sistema circadiano de Neurospora crassa y creen que puede ser la primera comprensión molecular detallada de un sistema circadiano complejo. [15]