El gen de frecuencia ( frq ) codifica la proteína frequency (FRQ) que funciona en el reloj circadiano de Neurospora crassa . La proteína FRQ juega un papel clave en el oscilador circadiano, sirviendo para nuclear el complejo de elementos negativos en el bucle de retroalimentación negativa de transcripción-traducción autorregulador (TTFL) que es responsable de los ritmos circadianos en N. crassa . [1] Se encuentran ritmos similares en mamíferos, Drosophila y cianobacterias. Recientemente, se han identificado homólogos de FRQ en varias otras especies de hongos. [2] La expresión de frq está controlada por los dos factores de transcripción white collar-1 (WC-1) y white collar-2 (WC-2) que actúan juntos como el complejo White Collar (WCC) y sirven como el elemento positivo en el TTFL. La expresión de frq también puede inducirse a través de la exposición a la luz de una manera dependiente de WCC. La genética directa ha generado muchos alelos de frq que dan como resultado cepas cuyos relojes circadianos varían en la duración del período.
El locus frq fue descubierto por Jerry F. Feldman. Feldman había sido estudiante de posgrado con Colin Pittendrigh en Princeton y fue a Caltech en 1967 para comenzar a realizar pruebas genéticas para mutantes del reloj circadiano. La prueba fue ayudada por un trabajo reciente que mejoró la expresión del ritmo en Neurospora . Colin Pittendrigh y sus colegas habían confirmado en 1959 que el ciclo diario de desarrollo asexual, descrito anteriormente en Neurospora crassa por Brandt, [3] se debía de hecho a la regulación por un reloj circadiano . [4] En un trabajo publicado poco antes de que Feldman llegara a Caltech, Malcolm L. Sargent, Winslow R. Briggs y Dow O. Woodward en la Universidad de Stanford informaron que la expresión manifiesta del ritmo de desarrollo en la conidiación se mejoró en una cepa de Neurospora llamada Timex. [5] (Esta cepa contenía una mutación en la banda del locus (bd) , que luego se demostró que codificaba un alelo levemente hiperactivo de ras-1, por lo que las cepas ahora se conocen como ras-1[bd] . [6] Debido a que los ritmos en cepas que incluyen ras-1[bd] son más fáciles de detectar, ras-1[bd] a menudo se incorpora en cepas utilizadas para estudios de biología circadiana en Neurospora . [6] ). Los resultados del reloj circadiano de Neurospora incluyen la síntesis de carotenoides , así como la formación asexual de esporas observada en los tubos de carrera, y la evidencia reciente sugiere que miles de genes están bajo control circadiano. [7] [2]
Feldman utilizó nitrosoguanidina como mutágeno y utilizó tubos de prueba para examinar las cepas individuales que sobrevivieron a la mutagénesis en cuanto a la duración de su período circadiano. Los tubos de prueba son tubos de vidrio huecos largos doblados en ambos extremos para contener un medio de crecimiento de agar. Cuando se inocula Neurospora en un extremo de un tubo, crecerá hasta el otro extremo y, en oscuridad constante, se manifiesta el ciclo circadiano diario de crecimiento y desarrollo. [8] Aunque las pruebas de Feldman tuvieron éxito, tardó en publicarlas, por lo que la identidad de los genes mutantes frq [1], frq [2] y frq [3] no se informó hasta 1973. [9] En 1986, Jay Dunlap y sus colegas clonaron frq utilizando una estrategia que implicaba un largo recorrido cromosómico y la aplicación exitosa de la estrategia entonces no probada de rescatar a un mutante conductual arrítmico mediante la transformación de ADN exógeno que surge del recorrido cromosómico. El éxito de esta estrategia y de la clonación de un gen del reloj despertó el interés por seguir investigando y comprender el reloj circadiano de N. crassa . [10] Más tarde se demostró que la expresión de frq tenía un ciclo rítmico; además, cuando se diseñaron cepas de Neurospora en las que la expresión de frq podía impulsarse desde una región distinta del gen de tipo salvaje residente , se descubrió que FRQ reprimía su propia expresión y que ningún nivel de expresión constante podía sustentar un reloj circadiano. [11] Estos experimentos fueron los primeros en manipular la expresión de un gen del reloj a través de medios que no afectaban al reloj y establecieron que la retroalimentación negativa autorregulatoria que da lugar a la expresión cíclica del gen del reloj se encontraba en el núcleo del oscilador circadiano.
Como reflejo de su papel como proteína central del reloj, la eliminación del gen frq produce arritmicidad y, en Neurospora , la única función de FRQ es en el reloj circadiano. El gen frq se puede activar a partir de dos secuencias distintas que actúan en cis en su promotor, un sitio distal, la caja del reloj, que se utiliza en el contexto de la regulación circadiana, y un sitio cercano al sitio principal de inicio de la transcripción que se utiliza para la expresión inducida por la luz (el elemento regulador de la luz proximal o PLRE). Estas transcripciones frq tienen la capacidad de codificar dos proteínas FRQ, una forma larga de 989 aminoácidos (lFRQ) y una forma corta de 890 aminoácidos (sFRQ); tanto lFRQ como sFRQ son necesarias para una fuerte ritmicidad, aunque el reloj puede persistir a ciertas temperaturas, aunque con una ritmicidad más débil, con solo una de las proteínas presente. [13] La elección de la proteína que se va a utilizar es el resultado de un empalme dependiente de la temperatura de la transcripción primaria, de modo que incluya o excluya el codón de inicio ATG para lFRQ. [14] Las dos formas de FRQ proporcionan al reloj de Neurospora un mayor rango de temperaturas en las que puede funcionar de manera óptima. Un aumento de la temperatura conduce a una mayor expresión de lFRQ, mientras que sFRQ no se ve afectado. Las temperaturas más cálidas inducen un empalme más eficiente de un intrón en el sitio de inicio de la traducción. [7] Debido a que sFRQ favorece un período más largo que lFRQ, los ritmos de funcionamiento libre en Neurospora de tipo salvaje disminuyen un poco con el aumento de la temperatura. [7]
También se ha demostrado que FRQ interactúa con varias otras proteínas. Interactúa en todo momento con FRH (ARN helicasa que interactúa con FRQ ; una helicasa de ARN que contiene la caja DEAD esencial en Neurospora ) para formar un complejo FRQ/FRH (FFC). [15] [16] FRQ también interactúa de forma estable con la caseína quinasa 1 (CK1), aunque la fuerza de la interacción cambia con la hora del día. Se conocen interacciones adicionales con otras quinasas, incluidas PRD-4 (CHK2) [17] y caseína quinasa 2 (CKII).
Los programas de predicción estructural sugieren que es probable que solo unas pocas regiones de FRQ se plieguen en estructuras estables y, en consonancia con esto, una variedad de datos experimentales indican que FRQ es una proteína intrínsecamente desordenada . [18] En ausencia de su pareja FRH, FRQ es muy inestable. Se predice que la miríada de fosforilaciones específicas según el momento del día que caracterizan a FRQ proporcionarán estructura a esta proteína que de otro modo estaría desordenada. No se conoce la estructura de dominio de FRQ debido a su estructura altamente desordenada.
Por lo general, las proteínas muestran un sesgo en el uso de codones, en el que es más probable que elijan codones sinónimos que están más disponibles en su grupo de ARNt . Neurospora crassa tiene un sesgo de uso de codones relativamente fuerte en comparación con S. cerevisiae , un organismo comúnmente utilizado para el análisis de optimización de codones. Sin embargo, debido a que FRQ es una proteína intrínsecamente desordenada, no ha demostrado un sesgo en el uso de codones. De hecho, cuando sus codones están optimizados, la proteína pierde su función y el reloj se altera. Este no es el caso de los genes del reloj de las cianobacterias , kaiB y kaiC , que condujeron a una función del reloj más robusta. [19]
Una descripción de la regulación de frq y FRQ requiere una descripción del ciclo del reloj. La base molecular del oscilador circadiano en Neurospora comienza con dos complejos proteicos. Uno es el FFC, el complejo de elementos negativos compuesto por dos copias de FRQ, FRH y caseína quinasa 1, así como, probablemente, otras proteínas unidas con menos fuerza. [16] El otro complejo que actúa como elemento positivo en el ciclo de retroalimentación incluye WC-1 y WC-2; son factores de transcripción GATA que, juntos, forman el heterodímero WCC a través de sus dominios PAS . [21] Cuando el WCC se libera del complejo de elementos negativos FFC durante la noche subjetiva, se une al promotor del gen clock-box within frequency ( frq ) y activa la transcripción de frq . [22] [23] Recientemente se ha demostrado que la histona H3 lisina 36 metiltransferasa , SET-2, es responsable de la metilación del gen frq para establecer un estado de cromatina que permitirá la transcripción de frq por el WCC. [24]
La proteína de frecuencia (FRQ) se acumula y es fosforilada progresivamente por CKI, CKII y una quinasa dependiente de calcio/calmodulina (CAMK-1), y quinasas adicionales, alcanzando su pico alrededor de la mitad del día subjetivo. [25] [26] [27] Los inhibidores de quinasas reducen la degradación de FRQ al prevenir la fosforilación. [28] La FRQ se fosforila en más de 100 sitios según análisis in vitro utilizando espectrometría de masas de péptidos lFRQ. Estos sitios aparecen dentro de la proteína de una manera altamente reproducible, lo que indica que el momento de las fosforilaciones es importante. Además, la mutación de los sitios muestra que funcionan en dominios, con algunas fosforilaciones que sirven para alargar el período y otras para acortarlo. [16]
La FRQ recluta quinasas como la caseína quinasa 1a (CK-1a) que fosforilan el WCC, aunque la función de estas fosforilaciones no está clara ya que el WCC hiperfosforilado permanece activo. Finalmente, la represión se alivia cuando la FRQ se vuelve tan altamente fosforilada que el FFC ya no interactúa con el WCC. Este proceso ocurre con una periodicidad de alrededor de 22 horas en condiciones constantes. [29] En un momento posterior, y con una cinética que no influye en el ciclo circadiano, esta FRQ hiperfosforilada se degrada a través de la vía ubiquitina/proteasoma. La FRQ altamente fosforilada sufre un cambio conformacional que es detectado por la proteína FWD-1, que es parte de la ligasa SCF tipo E3. [30]
FRQ forma un homodímero a través de su dominio de hélice superenrollada ubicado cerca del extremo N. Esta dimerización es necesaria para que FRQ interactúe con el dominio de hélice superenrollada y reprima su propia expresión. [31] La eliminación del dominio de hélice superenrollada conduce a una incapacidad para formar el homodímero, lo que hace que FRQ ya no esté regulada negativamente por la concentración de FRQ. [31] Esto conduce a arritmicidad. [31]
Se ha propuesto un circuito de retroalimentación positiva entre FRQ y WCC, pero aún no se conocen los detalles. Se cree que WCC se degrada cuando está activo desde el punto de vista transcripcional y que la prevención de esto causada por FFC permite una acumulación de WCC. [32] Se ha demostrado que este mecanismo propuesto es posiblemente más complejo, ya que FRQ puede regular WC-1 y WC-2 de forma independiente. [33] Recientemente, se identificó al factor de transcripción ADV-1 como un transductor necesario de las salidas del reloj, incluida la ritmicidad circadiana en genes críticos para la fusión de células somáticas . [34]
El gen frq se induce fuertemente con la exposición a la luz durante un corto período de tiempo. Debido a que el núcleo del reloj se basa en la expresión rítmica de frq , la inducción aguda por luz proporciona una manera sencilla de reiniciar el reloj. [35] Los relojes de los mamíferos se reinician con la luz mediante un mecanismo casi idéntico, y las transcripciones de mPer1 se inducen con destellos cortos de luz fuera del día subjetivo. El mecanismo de mPer1 en el reloj de los mamíferos presenta mayores similitudes con el mecanismo de Neurospora que con el mecanismo de su homólogo en Drosophila , per . [36]
La genética directa se ha utilizado para crear mutantes de reloj de Neurospora con distintos períodos de conidiación . Aunque se ha descrito que nueve alelos proceden de la genética directa, el análisis de secuencias posterior a la clonación de frq mostró que frq [2], frq [4] y frq [6] compartían el mismo cambio de base única, y de la misma manera frq [7] y frq [8] tenían el mismo cambio de base única, por lo que se han eliminado los alelos redundantes. [37] Los períodos de varios mutantes frq que surgieron de los análisis directos son los siguientes cuando se miden a 25 °C, aunque debido a que frq [3] y frq [7] dan como resultado relojes con compensación de temperatura alterada, los períodos serán diferentes a otras temperaturas:
Se han descubierto varios osciladores identificables distintos fuera del sistema FRQ/WCC; sin embargo, ninguna de estas oscilaciones sin FRQ (FLO) satisface las características para ser clasificadas como osciladores circadianos . [38] Se ha demostrado que el oscilador circadiano FRQ-WCC (FWO), a través de informes de luciferasa , continúa funcionando incluso cuando un FLO (el CDO u oscilador de deficiencia de colina que controla la conidiación en condiciones de limitación de colina) controla la conidiación. [38] En el mutante frq[9] Neurospora crassa , todavía se observó un ritmo no compensado por la temperatura del desarrollo de conidiosporas en oscuridad constante (DD). [39] El período para mutantes nulos frq varió de 12 a 35 horas, pero se pudo estabilizar mediante la adición de farnesol o geraniol . Sin embargo, este mecanismo no se entiende bien. [40] Aunque este ritmo sin FRQ perdió ciertas características del reloj, como la compensación de temperatura, los pulsos de temperatura fueron suficientes para reiniciar el reloj. [41] Otro FLO es el NRO u oscilador de nitrato reductasa que aparece en condiciones de carencia de nitrato y se cree que surge de bucles de retroalimentación dentro de la vía de asimilación de nitrato; tiene una duración de período de aproximadamente 24 horas, pero no está compensado por la temperatura. [42] En resumen, hay mucha evidencia que respalda los osciladores sin FRQ en Neurospora crassa. Una forma de racionalizar esto es asumir que muchos son "esclavos" del oscilador de frecuencia/cuello blanco; no poseen todas las características de un reloj circadiano por sí solos porque esto es proporcionado por el FWO. [40] Sin embargo, los ritmos en el gen 16 controlado por reloj (ccg-16) están acoplados al FWO pero funcionan de manera autónoma, lo que demuestra que Neurospora crassa contiene al menos 2 marcapasos potenciales, pero solo uno que puede restablecerse con luz y temperatura mientras mantiene la compensación de temperatura. [40] [43] Nunca se ha demostrado que el oscilador sin FRQ afecte al verdadero reloj circadiano. [43] El mecanismo y la importancia de los osciladores sin FRQ (FLO) aún están bajo investigación.
La proteína FRQ se conserva dentro de Sordariacea pero diverge fuera de este grupo. [2] [44] No obstante, se han encontrado relojes circadianos auténticos basados en FRQ en organismos distintos de Neurospora tanto dentro de Sordariacea , por ejemplo, en el patógeno fúngico saliente Botrytis, [45] y también tan lejos como Pyronema [46] dentro de Pezizomycetes, un linaje de ascomicetos filamentosos de divergencia temprana. Frq incluso se encontró en el grupo de hongos no Dikarya. El hallazgo de frq y el mecanismo de reloj circadiano conservado dentro de los hongos micorrízicos arbusculares no Dikarya expandió la historia evolutiva de este gen en el reino Fungal. [47] frq parece divergir muy rápidamente durante su evolución. Una parte de la razón por la que la secuencia de aminoácidos primaria de FRQ diverge tan rápidamente puede ser porque es una proteína intrínsecamente desordenada y, como resultado, carece de las restricciones estructurales que limitan los cambios de secuencia. [48] [18] Dado que la optimización de codones del gen frq da como resultado una función deteriorada del bucle de retroalimentación circadiano , frq muestra un sesgo de uso de codones no óptimo en su marco de lectura abierto en contraste con la mayoría de los otros genes. [49] FRQ es una proteína intrínsecamente desordenada que no está bien conservada, incluso en hongos. [50] Sin embargo, a diferencia de FRQ, WC-1 está muy bien conservado. Es el miembro fundador de la familia de fotorreceptores de luz azul utilizados en todo el reino de los hongos. Además, es similar en estructura y función a BMAL1 . La caseína quinasa 2 se conserva en los osciladores circadianos de plantas ( Arabidopsis ) y moscas ( Drosophila ). [30] Una forma similar de CKI es necesaria para la degradación de las proteínas del período (PER) en Drosophila y mamíferos. [30] El gen slimb de Drosophila es ortólogo de FWD1 en Neurospora , los cuales son cruciales para la degradación de la proteína del reloj. [30] En general, los TTFL que se encuentran en hongos y animales comparten una arquitectura reguladora similar, con un ciclo de retroalimentación negativa de un solo paso, activadores heterodiméricos PAS-PAS que se conservan y proteínas de elementos negativos que carecen en gran medida de estructura y están mucho menos conservadas. Una paleta similar de quinasas modifica las proteínas del reloj en todos los casos.