El sitio predominante de corte es el enlace peptídico adyacente al grupo carboxilo de los aminoácidos alifáticos y aromáticos con grupos alfa amino bloqueados.
Aunque los iones de calcio no afectan la actividad enzimática, sí contribuyen a su estabilidad.
[5] La proteinasa K tiene dos sitios de unión para Ca 2+ ubicados cerca del centro activo aunque no están directamente involucrados en el mecanismo catalítico.
La actividad residual es suficiente para digerir las proteínas, que normalmente contaminan las preparaciones de ácidos nucleicos.
La proteinasa K no es inhibida por cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, urea, Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, citrato, ácido yodoacético, EDTA o por otros inhibidores de la serina proteasa como la Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK) y Nα-Tosil-Phe Clorometil Cetona (TPCK)[cita requerida] .