El edificio se alza dentro del Jardín Cuadrado, aislado y rodeado de senderos, y cuenta con una luminosidad natural considerada perfecta para realzar el valor estético de las obras que alberga.
Antes de la construcción de la pinacoteca, las obras estaban repartidas entre los diferentes edificios apostólicos, debido a que no tenían una sede fija, por lo que su construcción sirvió también para resolver este problema.
En la segunda faja, Jesús orante con vestiduras sacerdotales, entre los Apóstoles y frente a un altar con los instrumentos de la Pasión.
En la predela, el único panel que ha perdurado muestra a San Esteban y otros dos santos.
Reverso: en el centro, Cristo en su trono con ángeles y un oferente a sus pies (el mismo Stefaneschi); a los lados, la crucifixión de San Pedro y la decapitación de San Pablo.
La sala contiene mayoritariamente obras de Filippo Lippi, Beato Angelico y Benozzo Gozzoli.
El cuadro constituye el episodio central del ciclo de pinturas encargadas también a Antoniazzo Romano y a los hermanos Davide y Domenico Ghirlandaio para la decoración de esta sede, y representa al papa Sixto IV sentado en su trono, otorgando a un arrodillado Bartolomeo Sacchi, apodado “Platina” su nombramiento como primer prefecto de la Biblioteca.
Junto al vicario de Cristo se sitúan los cardenales nepotes Pietro Riario (conocido como el protonotario Raffaele) con Giuliano della Rovere, en hábito cardenalicio (futuro papa Julio II) y sus sobrinos laicos Giovanni della Rovere y Girolamo Riario.
La tercera es representativa del período tardío de Rafael: en alto, Cristo transfigurado entre Moisés, Elías, Pedro, Juan y Jacobo, mientras, en el registro inferior, el episodio del encuentro entre un niño endemoniado y los apóstoles; tema implícito es el de la gracia sólo alcanzable con la fe, aquí representada por la mujer arrodillada en primer plano.
El cuadro más conocido es, sin embargo, el monocromo o grisalla San Jerónimo, de Leonardo, óleo sobre tabla, de finales del siglo XV, y perteneciente al primer periodo florentino del artista.
El santo aparece arrodillado y con la cabeza inclinada hacia un lado; su cuerpo, enjuto e implorante, personifica la ascesis y la mortificación; a sus pies tiene un famélico león, del cual queda rastro de su silueta, y al fondo se puede ver la fachada de la iglesia florentina de Santa Maria Novella.