[5]​ En ella les proponía la necesidad urgente de reunirse para poner orden en el reino y, principalmente, adoptar cinco objetivos concretos:[6]​ Las advertencias del cardenal Adriano para que las ciudades hiciesen oídos sordos a este llamamiento dieron el efecto deseado, pues en los primeros días de julio solo Salamanca, Segovia y Toro se mostraban conformes con enviar sus procuradores a la junta propuesta por Toledo.

[17]​ A algunas de ellas, como Soria y Guadalajara, es probable que la regencia encabezada por el cardenal Adriano les haya permitido acudir con sus procuradores para que, al menos, actuasen como elementos moderadores en el seno de la asamblea.

[20]​ Los procuradores reunidos en Ávila tomaron en cuenta esta disposición y el 6 de septiembre anunciaron su traslado a la ciudad que sería su nueva sede.

En la asamblea se hallaban representadas trece ciudades de las dieciocho con voto en Cortes: Burgos, Soria, Ávila, Valladolid, León, Salamanca, Zamora, Toledo, Toro, Cuenca, Guadalajara y Madrid; en octubre se le sumarían, además, los diputados de Murcia.

[24]​ Esta mayoría le permitió adoptar el nombre oficial de «Cortes y Junta General del Reino».

Casi desde el principio, la Santa Junta había manifestado su intención de devolverle a Juana las prerrogativas políticas que le pertenecían como legítima soberana del reino.

Los diputados más radicales de la Junta sostenían que Juana era víctima de un complot político para apartarla del poder y que, por tanto, su locura no era tan grave como se afirmaba o, por lo menos, podía ser tratada con éxito para favorecer su recuperación.

[31]​ Es cierto que la reina experimentó una apreciable transformación tras los primeros contactos con los comuneros, pero estos cambios no dejaron de ser transitorios, dado que siempre terminaba regresando a sus estados de melancolía e indiferencia.

[32]​ Los inconvenientes que planteaba este hecho, sumados a su inestable estado mental, provocaron que los comuneros se resignasen y abandonasen la posibilidad de oponer la reina legítima a su hijo Carlos.

Es decir, si debía tratarse de una asamblea consultiva cuya única responsabilidad era ponerse de acuerdo en las reformas necesarias y pedirle al rey que las tuviese en cuenta, o por el contrario, su misión era constituirse en un verdadero gobierno provisional con poder real y efectivo para dirigir el país en ausencia del monarca.

[35]​ Fue la revocación del Consejo Real, votada el 21 de septiembre, lo que hizo aumentar la tensión entre Burgos y la Junta.

[38]​ En octubre le exigió al cardenal Adriano, a quien el rey había conservado en su puesto, que dejase de intervenir en la gobernación del reino.

[39]​ Fue por entonces cuando la ciudad de Burgos ya estaba ultimando negociaciones para cambiar al bando realista y abandonar definitivamente la Santa Junta.

[43]​ Al mismo tiempo que atendía diligencias en el plano militar, la Junta no descartaba iniciar negociaciones con algunos elementos del poder real.

[46]​ El Almirante replicó esta cuestión planteando que el anhelo por una república en Castilla resultaba absurdo y que, por lo demás, la Junta no estaba en derecho de afirmar que representaba la voluntad nacional porque, ciertamente, no todas las ciudades con voto en Cortes se hallaban reunidas en ella, ni tampoco regiones como Andalucía, Galicia, Asturias o el País Vasco habían enviado sus representantes.

Con respecto a las Cortes, los comuneros perfilaron un modelo institucional radicalmente opuesto al que había cristalizado en Castilla durante la Edad Media.

[51]​ Tendrían, además, libertad para elegir presidente y fijar tanto la orden del día como la duración de las sesiones.

[49]​[53]​ Para garantizar su imparcialidad, las instrucciones que recibieren debían ser redactadas libremente por el ayuntamiento, sin presiones externas del monarca o la Corte.

[55]​ Otros capítulos redactados por la Junta buscaban mejorar el alistamiento de los funcionarios y examinar su gestión.

Los cargos deberían servirse por un tiempo limitado y reducido, con rendiciones de cuentas cada cuatro años.

En el plano económico, las propuestas de los comuneros giraron en torno a sanear la Hacienda de la Corona, proteger el patrimonio real y reducir las cargas fiscales que recaían sobre la población castellana.

[65]​ La derrota de Tordesillas debilitó numéricamente a la Junta; Soria y Guadalajara no volvieron a enviar representantes y, en total, trece diputados habían sido hechos prisioneros durante la batalla:[66]​ Cuando la Junta reanudó sus sesiones en Valladolid el 15 de diciembre, solo diez ciudades estaban representadas en ella: Toledo, León, Murcia, Salamanca, Toro, Segovia, Cuenca, Ávila, Zamora y Valladolid, aunque días más tarde se sumarían los de Madrid.

Esta vez, Hernán Gómez de Alcocer intervino en la discusión para expresar su total confianza en los soldados del ejército rebelde.

Pedro de Losada, en cambio, se situó en terreno neutral al afirmar que la Junta no estaba facultada para intervenir en esos asuntos.

[86]​ Días antes, el 7, había confiado al doctor San Pedro, al licenciado Morales, a fray Pablo de León y a otro letrado, la labor de instruir el proceso contra «los enemigos del reino».

[87]​ Si bien las negociaciones lograron avanzar en ciertos puntos, no pudieron cristalizar en una solución de compromiso.

[88]​ Tras la finalización de la tregua de marzo, la guerra civil continuó, Pero Laso y el bachiller Guadalajara abandonaron la causa rebelde[89]​ y la situación militar se complicó sobremanera para las tropas comuneras acantonadas en Torrelobatón.

[93]​ El procurador salmantino Francisco Maldonado, por su parte, se ocupaba de la correspondencia y los correos.

La Santa Junta se mostró particularmente preocupada por la situación financiera en la que estaba sumida el reino castellano.

[97]​ En este campo de acción, la Junta ejerció las atribuciones judiciales que regularmente correspondían al Consejo Real.