Se convirtió en heredero al trono de Portugal en 1539 después de la muerte en la infancia de sus cuatro hermanos mayores.

De todos sus hermanos solo él y María Manuela, sobrevivieron a la infancia.

En 1552, con solo 15 años, contrajo matrimonio en Toro (Zamora) con la archiduquesa Juana de Austria,[1]​ infanta española hija del rey Carlos I, su prima hermana por los lados paterno y materno.

Su breve unión ha sido descrita como feliz.

Juan murió de diabetes juvenil (posiblemente heredada de su abuelo materno Felipe el Hermoso) en 1554, su joven viuda dio a luz 18 días después de la muerte de su marido a un hijo:[1]​