Isabel de Portugal y sus hermanos eran castigados por su madre, cuando lo merecían, sin perdonar a ninguno.

El consentimiento portugués había permitido que Castilla cimentase su posición en las Canarias y sobre territorios del Reino de Fez y su apoyo era necesario para combatir a los infieles en Berbería.

En 1521, Carlos se comprometió con su otra prima hermana, María Tudor, hija de Enrique VIII y Catalina de Aragón, que era 16 años más joven que él y todavía una niña.

[5]​ En 1525, Carlos ya no estaba interesado en una alianza con Inglaterra y no podía esperar más a que María se hiciera mayor porque estaba decidido a tener hijos legítimos.

Carlos no perdió tiempo en conseguir una dispensa papal para los primos hermanos y se formalizó el contrato matrimonial para una alianza con Portugal: Isabel se casaría con él y su hermano, el rey Juan III de Portugal, con la hermana menor de Carlos, Catalina de Austria.

[7]​[8]​ Aunque su matrimonio fue un acuerdo político, Isabel cautivó a Carlos, que se quedó con ella más tiempo del previsto.

Las semillas crecieron hasta convertirse en el clavel rojo, que le encantó.

Entonces ordenó que se plantarán miles más en su honor, estableciendo el clavel rojo como emblema floral de España.

A pesar del afecto mutuo que se profesaban, su matrimonio no fue fácil.

Aunque regresó brevemente en 1538, se marchó casi inmediatamente, volviendo en noviembre de 1539.

Se especula con que padecía tisis, y un contemporáneo la describe así:

En 1539 se quedó embarazada por séptima vez, pero en el tercer mes contrajo otra fiebre que le causó complicaciones prenatales y dio a luz a un niño muerto.

Carlos I murió viudo en 1558, con la misma cruz en la mano que llevaba ella al morir.

[12]​ Otro tributo musical a ella es Carole cur defles Isabellam que fue compuesta en 1545 por el compositor franco-flamenco Nicolas Payen.