Fue la hija mayor del tercer matrimonio del rey Felipe II de España y de su esposa Isabel de Valois, y también la más querida por el monarca siendo la única a la que le estaba permitido ayudarle en su trabajo, revisando documentos y traduciendo para su padre documentos del italiano al español.

Fue bautizada por Juan Bautista Castaneo, nuncio apostólico, después papa como Urbano VII, y fue su padrino su tío don Juan de Austria.

Entonces Felipe II realizó toda una serie de gestiones políticas, reclamando la corona de Francia para su hija Isabel Clara Eugenia.

Sin embargo, Francia estaba regida por la Ley Sálica, e Isabel de Valois había renunciado a sus derechos al trono con motivo de su matrimonio con Felipe II.

En 1621 falleció Alberto de Austria y, al no haber hijos sobrevivientes del matrimonio, los Países Bajos volvieron a la Corona española.