Su tío Guidobaldo da Montefeltro, sin descendencia directa, lo quiso a su lado en la corte de Urbino y en 1504 le presentó como su sucesor tras haberlo adoptado, a través de la intercesión del papa Julio II.

Además gracias al apoyo de Juliano della Rovere, tío suyo, ascendido al trono pontificio en 1503 como Julio II, pudo finalmente recuperar el control de Senigallia.

Este conflicto, conocido como guerra de Urbino no generaría ningún resultado positivo inmediato para el viejo duque, que sólo recuperará su estado en 1521, a la muerte del Papa León X de la familia Medici.

Tras haber combatido en Lombardía hasta 1525, durante el pontificado de otro Médici, Clemente VII, Della Rovere se quedaría lentamente al margen de la escena.

Posteriormente, para oponerse al Papa en el dominio de las Marcas, organizó el matrimonio de su hijo Guidobaldo II della Rovere con Giulia da Varano.

Tuvieron los siguientes hijos: En la florentina Galleria degli Uffizi hay dos retratos del Duque de Urbino.