Carlos no tenía descendencía masculina y con él la rama principal de los Saboya se extinguía.

En 1501 se volvió a casar con Margarita de Austria, hija del emperador Maximiliano I del Sacro Imperio y futura madrina de Carlos V.

A finales de octubre o principios de noviembre, tuvo lugar en Dole la boda por poderes entre el duque, representado por su medio hermano René, y Margarita.

Para mantener su neutralidad, Filiberto II negó a los franceses en 1502 el paso por sus Estados para penetrar en la Italia del norte; las fuerzas del rey de Francia se apoderaron entonces de los valles controlados por el marquesado de Saluzzo, lo que permitió a Saboya mantenerse al margen del conflicto.

También conquistó Milán, que era la vecina de Saboya al este, poniendo a los saboyanos bajo la órbita francesa.

El médico fue detenido, torturado y denunciado a sus hipotéticos cómplices.