Eustace Chapuys fue el segundo de seis hermanos, su padre, Louis Chapuys, fue notario y síndico y su madre Guigonne Dupuys, pudo haber sido de noble cuna.
Nació entre 1490 y 1492 en Annecy, localidad actualmente francesa que perteneció al Ducado de Saboya.
Posteriormente sirvió al propio duque y a Carlos de Borbón.
Catalina había solicitado específicamente a Chapuys como reemplazo de Mendoza, por su experiencia legal y su dominio del latín.
Se ha creído que Chapuys despreciaba Ana Bolena y nunca pronunciaba su nombre, refiriéndose a ella sólo como "puta" o "concubina".
Chapuys llegó a convertirse en el confidente más leal de la futura reina.
El emperador le permitió renunciar sólo después de introducir a su sustituto François van der Delft.
Como embajador, la herencia de unas tierras en Annecy y varias prebendas eclesiásticas, llegó a conseguir una buena pensión que le permitió acumular cierta riqueza.
Aún a pesar de estar retirado, actuó cómo asesor del emperador entre 1547 y 1549.