Su estructura tienen forma de "L" con un gran dominio en la membrana (con alrededor de 60 hélices transmembrana) y un dominio periférico hidrófilo donde se produce la reducción del NADH.
La transferencia electrónica se inicia mediante la oxidación del NADH ya que sus dos electrones son transferidos simultáneamente a un FMN unido no covalentemente a la enzima, y desde allí, a través de una serie de clusters Fe-S (transportadores de electrones capaces de aceptar un electrón por ciclo) al aceptor final, la coenzima Q (ubiquinona, transportador electrónico liposoluble) o a aceptores artificiales como ferrocianuro o rutenio (III) hexaamina.
[1][2] Simultáneamente al transporte electrónico, el complejo I bombea protones a través de la membrana, contribuyendo así a la generación de un gradiente electroquímico.
[6][7] Más de cien genes están involucrados en la biosíntesis del complejo I, participan en: transcripción, traducción, transporte, procesamiento, inserción de cofactores y ensamblado.
[8][9] Mutaciones en las subunidades del complejo I pueden causar enfermedades mitocondriales, entre las que destaca el síndrome de Leigh.