Las pioverdinas [1] (alternativamente, y con menos frecuencia, escritas como pyoverdinas ) son sideróforos fluorescentes producidos por ciertas pseudomonas . [2] [3] Las pioverdinas son factores de virulencia importantes y son necesarias para la patogénesis en muchos modelos biológicos de infección . Sus contribuciones a la patogénesis bacteriana incluyen proporcionar un nutriente crucial (es decir, hierro ), regular otros factores de virulencia (incluidas la exotoxina A y la proteasa PrpL), [4] apoyar la formación de biopelículas , [5] y son cada vez más reconocidos por tener toxicidad. ellos mismos. [6] [7] [8]
Las pioverdinas también se han investigado como moléculas de " caballo de Troya " para la administración de antimicrobianos a cepas bacterianas que de otro modo serían resistentes , como quelantes que pueden usarse para la biorremediación de metales pesados y como indicadores fluorescentes utilizados para analizar la presencia de hierro y potencialmente otros metales. . [9]
Debido a que cierran las brechas entre la patogenicidad , el metabolismo del hierro y la fluorescencia, las pioverdinas han despertado la curiosidad de los científicos de todo el mundo durante más de 100 años. [ cita necesaria ]
Como la mayoría de los sideróforos, la pioverdina se sintetiza y secreta al medio ambiente cuando el microorganismo que la produce detecta que las concentraciones de hierro intracelular han caído por debajo de un umbral preestablecido. Aunque el hierro es el cuarto elemento más abundante en la corteza terrestre , la solubilidad de los compuestos de hierro biológicamente relevantes es extremadamente baja y generalmente insuficiente para las necesidades de la mayoría (pero no de todos) los microorganismos. Los sideróforos, que suelen ser bastante solubles y tienen una avidez excepcionalmente alta por el hierro (III) (la avidez de algunos sideróforos por el hierro supera los 10 40 M -1 y muchas de las avidez más fuertes jamás observadas en la naturaleza las exhiben los sideróforos por el hierro), ayudan aumentar la biodisponibilidad del hierro al incorporarlo a una solución acuosa.
Además de esta función, la pioverdina tiene otras funciones, incluida la regulación de la virulencia, [4] [5] limitando el crecimiento de otras especies bacterianas (y sirviendo como una especie de antimicrobiano) al limitar la disponibilidad de hierro y secuestrando otros metales y evitando su toxicidad.
Aunque se han aislado y estudiado muchas (>100) formas de pioverdina, todas tienen ciertas características en común. Cada molécula de pioverdina tiene tres partes: un núcleo de dihidroxiquinolina, un péptido de 6 a 14 aminoácidos que varía según las cepas y una cadena lateral (generalmente compuesta por un α- cetoácido de 4 a 5 carbonos del ciclo de Krebs/ácido cítrico ). El núcleo de la pioverdina es responsable de varias de sus propiedades, incluido su conocido color amarillento y su fluorescencia.
El núcleo de dihidroxiquinolina está compuesto de ácido (1S)-5-amino-2,3-dihidro-8,9-dihidroxi-1H-pirimido[1,2-a] quinolin -1-carboxílico. Esta porción de la molécula es invariante entre todas las moléculas de pioverdina observadas.
El núcleo se modifica mediante la adición de una cadena de aminoácidos compuesta por 6-14 aminoácidos. La cadena de aminoácidos se construye en el núcleo del cromóforo y se sintetiza mediante síntesis de péptidos no ribosómicos . [10] [11] Como es común en los péptidos sintetizados no ribosómicamente, la pioverdina incluye con frecuencia aminoácidos en forma D y aminoácidos no estándar, como N -5-formil- N -5-hidroxiornitina . La cadena peptídica también puede estar ciclizada parcial (o completamente). Esta cadena peptídica proporciona los otros cuatro aspectos de la interacción hexadentada , generalmente a través de grupos hidroxamato y/o hidroxicarboxilato. Esta porción de la molécula también es crucial para la interacción con el receptor de ferripioverdina (FpvA) que permite que la ferripioverdina se importe a la célula. Actualmente se cree que la cadena peptídica producida por una cepa determinada de Pseudomonas es invariante.
Poco se sabe sobre la función particular o la importancia de la cadena lateral de cetoácido, pero es bien sabido [12] que coexisten moléculas de pioverdina con diferentes cetoácidos ( congéneres ). Los cetoácidos que se han observado incluyen succinato / succinamida , glutamato , glutarato , malato /malamida y α-cetoglutarato .
Entre sus otras características notables, las pioverdinas exhiben una fluorescencia brillante y relativamente fotoestable con espectros de excitación y emisión característicos que se apagan rápida y fuertemente al unirse a su ligando natural , el hierro. La excitación y la absortividad molar muestran una dependencia moderada del pH , pero la fluorescencia generalmente no se ve afectada por las variaciones del pH . A diferencia de la fluorescencia, la absorción espectroscópica muestra poca extinción tras la unión del hierro , lo que sugiere que el mecanismo de relajación molecular es vibratorio, en lugar de a través de radiación electromagnética .
La pioverdina coordina una quelación hexadentada (es decir, de seis partes) del hierro que involucra seis átomos de oxígeno diferentes (2 del núcleo de dihidroxiquinolina y 2 de cada uno de los 2 aminoácidos diferentes en la columna vertebral). Esto da como resultado un complejo octaédrico muy estrechamente coordinado que previene eficazmente la entrada de agua u otros materiales que puedan alterar la unión. Normalmente, el hierro férrico se elimina de la pioverdina mediante reducción al estado ferroso , para el cual la pioverdina tiene una avidez mucho menor (es decir, 10 9 M -1 ). Esto permite la eliminación no destructiva del hierro de la pioverdina. Después de la reducción, el hierro se "entrega" a otros portadores que tienen mayor afinidad por el hierro ferroso, mientras que la apopyoverdina se reexporta para su uso continuo.
La pioverdina es estructuralmente similar a la azobactina, de Azotobacter vinelandii , excepto que esta última posee un anillo de urea adicional. [13]
En Pseudomonas aeruginosa PAO1 hay 14 genes pvd implicados en la biosíntesis de pioverdina. [14]
La biosíntesis de pioverdina parece estar regulada en gran medida a través de la actividad del factor sigma alternativo PvdS que, a su vez, está regulado tanto por el sistema Fur como por el secuestro intracelular de PvdS en la membrana plasmática y lejos del nucleoide por el represor FpvI.
A pesar de una investigación importante, se sabe relativamente poco sobre la biosíntesis de pioverdina. Por ejemplo, no está claro si la biosíntesis de pioverdina tiene lugar como componentes individuales (es decir, el núcleo, la cadena peptídica y el cetoácido) o si el núcleo y las otras partes se condensan como una molécula inicial (posiblemente mediante la proteína PvdL). ) y luego modificado por otras enzimas. Por razones que aún no están claras, la biosíntesis de pioverdina es fuertemente inhibida por el fluorouracilo terapéutico contra el cáncer , [15] particularmente a través de su capacidad para alterar el metabolismo del ARN. [16] Aunque la producción de pioverdinas varía de una cepa a otra, se ha demostrado que las especies fluorescentes de Pseudomonas producen entre 200 y 500 mg/L cuando se cultivan en condiciones de agotamiento de hierro. [17] [18]
Existe cierta controversia sobre el origen del núcleo cromóforo fluorescente. Originalmente, se pensaba que era sintetizado por el operón pvcABCD , ya que la eliminación de porciones de los genes pvcC y pvcD interrumpe la producción de pioverdina. [19] Al igual que otros aspectos de la biosíntesis de pioverdina, la regulación de pvcABCD depende del hierro y la pérdida de la actividad de estos genes resultó en la alteración de la pioverdina.
Un informe separado sugiere que pvcABCD puede ser responsable de la síntesis de paercumarina (una molécula relacionada con pseudoverdina), y afirma que la pérdida de actividad en el locus no tiene ningún efecto sobre la producción de pioverdina. [20] Además, algunas Pseudomonas fluorescentes carecen de homólogos aparentes de estos genes, lo que cuestiona aún más si esta es la función de estos genes.
Esto es consistente con los informes de que pvdL combina la coenzima A con un resto de ácido mirístico y luego agrega un glutamato, D-tirosina y ácido L-2,4-diaminobutírico (DAB). [21] Una vía biosintética alternativa sugiere que pvdL incorpora glutamato, 2,4,5-trihidroxifenilalanina y ácido L-2,4-daminobutírico. [22] Esto último está respaldado por la identificación de la incorporación de una tirosina radiomarcada en pioverdina o pseudoverdina.
Esta discrepancia sigue sin resolverse.
Varios de los genes responsables de la biosíntesis de pioverdina (p. ej., pvdH, pvdA y pvdF ) participan en la generación de aminoácidos precursores y alternativos necesarios para diversas porciones de la molécula. [23] Varios otros (por ejemplo, pvdI y pvdJ ) son directamente responsables de "unir" la cadena peptídica. [23] pvdD termina la cadena y libera el precursor en el citoplasma , lo que es consistente con la identificación de moléculas similares a pioverdina en el citoplasma con cromóforos no completamente maduros. [23]
Actualmente, la mejor evidencia disponible sugiere que el cetoácido se une originalmente al núcleo del cromóforo (como L-glutamato) cuando se sintetiza a partir de D-tirosina, ácido L-2,4-diaminobutírico y L-glutamato. No está claro cómo esto se modifica posteriormente a otras formas congeneradas (es decir, a-cetoglutarato , succinato / succinamida , etc.).
Se ha interpretado que la localización de algunas de las proteínas Pvd en el periplasma y la membrana externa (como PvdN, PvdO, PvdP y PvdQ) sugiere que partes de la maduración de la pioverdina tienen lugar en esta ubicación, tal vez después de ser transportada a el periplasma por PvdE, que es homólogo a los exportadores de tipo ABC . Aún no está claro cómo se exporta la pioverdina completamente madura desde la célula. Una vez madurada por completo, la pioverdina se exporta desde el periplasma mediante la bomba de eflujo PvdRT-OpmQ .
Se ha informado de una ruta de síntesis orgánica completa para la pioverdina producida por la cepa PAO1 de P. aeruginosa [24] utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida . Este protocolo produjo pioverdina con un alto rendimiento (~48%) y se espera que aumente sustancialmente la capacidad de los científicos para generar derivados específicos en la estructura de pioverdina y facilitar la creación de sideróforos con ojivas antimicrobianas.
Se ha informado que la pioverdina es necesaria para la virulencia en una variedad de modelos de enfermedades , incluidos C. elegans y varios modelos de infección murina (p. ej., modelos de quemaduras, modelos de neumonía, etc.). [6] [15] [25]
Como se señaló anteriormente, la pioverdina contribuye de varias maneras a la virulencia general, incluida la regulación de su propia producción, la exotoxina A (que detiene la traducción) y la proteasa PrpL. [4] También hay evidencia de que, aunque no es esencial para su formación, la pioverdina contribuye a la producción y desarrollo de biopelículas que son importantes para la virulencia. [5]
Finalmente, la pioverdina se asocia con varios tipos de toxicidad por sí sola. En 2001, Albesa y sus colegas informaron que la pioverdina purificada a partir de una cepa de P. fluorescens exhibía una profunda citotoxicidad para los macrófagos de los mamíferos y que este efecto dependía al menos parcialmente de las especies reactivas de oxígeno . [26] Más tarde, Kirienko y sus colegas determinaron que la pioverdina es necesaria y suficiente para matar C. elegans , que ingresa a las células huésped, desestabiliza la dinámica mitocondrial e induce una respuesta hipóxica . [6] [7] La exposición desencadena una respuesta que es consistente con la hipoxia que depende de la proteína HIF-1 , lo que sugiere que el huésped percibe una condición en la que carece de las herramientas moleculares para generar ATP (generalmente, hierro, oxígeno y células reductoras). equivalentes) . [6] [7]
Una vez que se secreta pioverdina, se difunde libremente en el medio ambiente. La pioverdina unida a hierro (también conocida como ferripioverdina) puede ser absorbida por cualquier célula bacteriana con el receptor apropiado , aunque esto varía según las cepas. [27] Es importante destacar que esto crea un bien común que puede ser explotado por "tramposos" que conservan la capacidad de utilizar pioverdina pero han dejado de fabricarla. Dado que la producción de pioverdina es energéticamente costosa, esto puede crear una ventaja de aptitud física en las células que no la sintetizan. [28] [29] [30] [31] En consecuencia, la pioverdina se ha convertido en un rasgo modelo para estudiar la cooperación y explotación microbiana . [32] [33]
En P. aeruginosa , se ha demostrado que las bacterias “tramposas” no productoras de pioverdina i) evolucionan fácilmente a partir de un ancestro productor; [34] y ii) superar a las cepas que cooperan en cultivos mixtos de una manera dependiente de la densidad y la frecuencia. [35] [36] Dado que el uso de pioverdina se basa en la difusión pasiva y la producción de pioverdina es metabólicamente costosa, se sabe que las condiciones ambientales influyen en la probabilidad de una explotación exitosa. Se demostró que la ventaja competitiva de los no productores de pioverdina sobre los productores en cultivos mixtos se maximiza cuando los ambientes están bien mezclados y las moléculas se difunden fácilmente (estructura espacial baja) y cuando los costos y beneficios de la producción de pioverdina son altos, es decir, cuando el hierro es fuertemente concentrado. limitado. [30] [37] La mayoría de los estudios sobre la cooperación y el engaño de la pioverdina se han realizado utilizando aislados clínicos, pero recientemente también se demostró la explotación de sideróforos en aislados naturales de Pseudomonas de muestras no clínicas. [38] [39]
Actualmente, no se utiliza ninguna nomenclatura generalizada y sistemática para diferenciar las estructuras de pioverdina. En 1989 se propuso un sistema [40] que constaba de pioverdina tipo I, tipo IIa, tipo IIb y tipo III. En ese momento, sólo se conocían unas pocas estructuras de pioverdina y se anticipaba que se produciría mucha menos variación de la que se había observado. Como consecuencia de la tremenda heterogeneidad observada en la estructura peptídica y la observación de congéneres (pioverdinas de una sola cepa que difieren sólo en sus porciones de cetoácidos), la nomenclatura de las pioverdinas sigue siendo bastante tenue y ningún sistema ha obtenido aceptación universal.
Algunas Pseudomonas fluorescentes también producen un compuesto relacionado con la pioverdina, llamado pseudoverdina (formalmente conocido como 3-formilamino-6,7-dihidroxicumarina). [41] Se cree que la pseudoverdina y la pioverdina pueden surgir de un precursor común, la 2,4,5-trihidroxifenilalanina, que puede condensarse con ácido L-2,4-diaminobutírico para iniciar la producción de pioverdina. [41]
La pseudoverdina es relativamente similar a la pioverdina en su fluorescencia y otras propiedades espectroscópicas , y en su capacidad para quelar el hierro férrico, aunque con una afinidad mucho menor . [41] A diferencia de la pioverdina, es incapaz de transportar hierro a las células , probablemente debido a la ausencia de la cadena peptídica. [41] Otra diferencia es que la pseudoverdina no parece estar regulada por los mismos procesos que la pioverdina. [41]