Nucleoide

Región dentro de una célula procariota que contiene material genético

El nucleoide (que significa similar a un núcleo ) es una región de forma irregular dentro de la célula procariota que contiene todo o la mayor parte del material genético . ^{[1] [2] [3]} El cromosoma de un procariota típico es circular y su longitud es muy grande en comparación con las dimensiones de la célula, por lo que necesita compactarse para caber. A diferencia del núcleo de una célula eucariota , no está rodeado por una membrana nuclear . En cambio, el nucleoide se forma por condensación y disposición funcional con la ayuda de proteínas arquitectónicas cromosómicas y moléculas de ARN , así como por superenrollamiento de ADN . La longitud de un genoma varía ampliamente (generalmente al menos unos pocos millones de pares de bases) y una célula puede contener múltiples copias del mismo.

Todavía no se conoce una estructura de alta resolución de un nucleoide bacteriano, sin embargo se han investigado características clave en Escherichia coli como organismo modelo . En E. coli , el ADN cromosómico está en promedio superenrollado negativamente y plegado en bucles plectonémicos , que están confinados a diferentes regiones físicas y rara vez se difunden entre sí. Estos bucles se organizan espacialmente en regiones del tamaño de megabases llamadas macrodominios, dentro de las cuales los sitios de ADN interactúan con frecuencia, pero entre los cuales las interacciones son raras. El ADN condensado y organizado espacialmente forma un elipsoide helicoidal que está confinado radialmente en la célula. La estructura 3D del ADN en el nucleoide parece variar según las condiciones y está vinculada a la expresión génica, de modo que la arquitectura del nucleoide y la transcripción génica son estrechamente interdependientes y se influyen mutuamente de forma recíproca.

Formación del nucleoide de Escherichia coli A. Una ilustración de una conformación abierta del genoma circular de Escherichia coli . Las flechas representan la replicación bidireccional del ADN. La posición genética del origen de la replicación bidireccional del ADN ( oriC ) y el sitio de decatenación cromosómica ( dif ) en la región de terminación de la replicación ( ter ) están marcados. Los colores representan segmentos específicos del ADN como se analiza en C. B. Una ilustración de una forma de espiral aleatoria adoptada por el ADN circular puro de Escherichia coli en equilibrio térmico sin superenrollamientos ni factores estabilizadores adicionales. ^{[4] [5]} C. Una caricatura del cromosoma de una célula de Escherichia coli recién nacida . El ADN genómico no solo está condensado 1000 veces en comparación con su forma de espiral aleatoria pura, sino que también está organizado espacialmente. oriC y dif están localizados en la mitad de la célula, y regiones específicas del ADN indicadas por colores en A se organizan en dominios espacialmente distintos.

Fondo

En muchas bacterias, el cromosoma es una molécula de ADN de doble cadena cerrada covalentemente (circular) que codifica la información genética en forma haploide . El tamaño del ADN varía de 500.000 a varios millones de pares de bases (pb) que codifican de 500 a varios miles de genes según el organismo. ^[2] El ADN cromosómico está presente en las células en una forma muy compacta y organizada llamada nucleoide (que significa similar a un núcleo ), que no está envuelto por una membrana nuclear como en las células eucariotas. ^[6] El nucleoide aislado contiene 80% de ADN, 10% de proteína y 10% de ARN en peso. ^{[7] [8]}

La bacteria gramnegativa Escherichia coli es un sistema modelo para la investigación de nucleoides que estudia cómo el ADN cromosómico se convierte en nucleoide, los factores que intervienen en ello, lo que se sabe sobre su estructura y cómo algunos de los aspectos estructurales del ADN influyen en la expresión genética . ^{[2] [3]}

Hay dos aspectos esenciales de la formación de nucleoides: la condensación de un ADN grande en un espacio celular pequeño y la organización funcional del ADN en una forma tridimensional. El cromosoma circular haploide en E. coli consta de ~ 4,6 x 10 ⁶ pb. Si el ADN se relaja en la forma B , tendría una circunferencia de ~ 1,5 milímetros (0,332 nm x 4,6 x 10 ⁶ ). Sin embargo, una molécula de ADN grande como el ADN cromosómico de E. coli no permanece como una molécula rígida y recta en una suspensión. ^[5] El movimiento browniano generará curvatura y dobleces en el ADN. La longitud máxima hasta la cual un ADN de doble hélice permanece recto al resistir la curvatura impuesta por el movimiento browniano es de ~ 50 nm o 150 pb, que se denomina longitud de persistencia . Por lo tanto, el ADN puro se condensa sustancialmente sin ningún factor adicional; en equilibrio térmico, asume una forma de bobina aleatoria . ^{[4] [5]} La espiral aleatoria del ADN cromosómico de E. coli ocuparía un volumen (4/3 π r ³ ) de ~ 523 μm ³ , calculado a partir del radio de giro ( R _g = (√N a)/√6) donde a es la longitud de Kuhn (2 x longitud de persistencia), y N es el número de segmentos de longitud de Kuhn en el ADN (longitud total del ADN dividida por a ). ^[5] Aunque el ADN ya está condensado en la forma de espiral aleatoria, todavía no puede asumir el volumen del nucleoide que es menor que un micrón. Por lo tanto, la propiedad inherente del ADN no es suficiente: factores adicionales deben ayudar a condensar aún más el ADN en el orden de ~10 ³ (volumen de la espiral aleatoria dividido por el volumen del nucleoide). El segundo aspecto esencial de la formación del nucleoide es la disposición funcional del ADN. El ADN cromosómico no solo está condensado, sino que también está organizado funcionalmente de una manera que es compatible con los procesos de transacción del ADN, como la replicación , la recombinación , la segregación y la transcripción . ^{[9] [10] [11]} Casi cinco décadas de investigación a partir de 1971, ^[7]Se ha demostrado que la forma final del nucleoide surge de una organización jerárquica del ADN. En la escala más pequeña (1 kb o menos), las proteínas arquitecturales del ADN asociadas al nucleoide condensan y organizan el ADN doblando, formando bucles, puenteando o envolviendo el ADN. En una escala mayor (10 kb o más), el ADN forma bucles plectonémicos, una forma trenzada de ADN inducida por superenrollamiento. En la escala de megabases, los bucles plectonémicos se fusionan en seis dominios organizados espacialmente (macrodominios), que se definen por interacciones físicas más frecuentes entre los sitios de ADN dentro del mismo macrodominio que entre diferentes macrodominios. ^{[12] Las conexiones ADN-ADN de largo y corto alcance formadas dentro y entre los macrodominios contribuyen a la condensación y la organización funcional. Finalmente, el nucleoide es un} elipsoide helicoidal con regiones de ADN altamente condensado en el eje longitudinal. ^{[13] [14] [15]}

Condensación y organización

Nucleoide a escala ≥1 kb. Organización del ADN por proteínas asociadas al nucleoide. El ADN se representa como una línea recta o curva de color gris y las proteínas asociadas al nucleoide se representan como esferas azules.

Proteínas asociadas a nucleoides (NAP)

En los eucariotas, el ADN genómico se condensa en forma de una matriz repetida de partículas de ADN y proteína llamadas nucleosomas . ^{[16] [17] [18]}

Un nucleosoma consta de ~146 pb de ADN envuelto alrededor de un complejo octamérico de las proteínas histonas . Aunque las bacterias no tienen histonas, poseen un grupo de proteínas de unión al ADN denominadas proteínas asociadas a nucleoides (NAP, por sus siglas en inglés) que son funcionalmente análogas a las histonas en un sentido amplio. Las NAP son muy abundantes y constituyen una proporción significativa del componente proteico del nucleoide. ^[19]

Una característica distintiva de las NAP es su capacidad de unirse al ADN tanto de manera específica (ya sea de secuencia o de estructura) como de manera no específica de secuencia. Como resultado, las NAP son proteínas de doble función. ^{[20] La unión específica de las NAP está involucrada principalmente en} la transcripción específica de genes , la replicación , la recombinación y la reparación del ADN . ^{[9] [10] [11]} En el pico de su abundancia, el número de moléculas de muchas NAP es varios órdenes de magnitud mayor que el número de sitios de unión específicos en el genoma. ^[20] Por lo tanto, se razona que las NAP se unen al ADN cromosómico principalmente en el modo no específico de secuencia y es este modo el que es crucial para la compactación cromosómica. La unión no específica de secuencia de una NAP puede no ser completamente aleatoria; podría haber una especificidad de secuencia baja y/o especificidad estructural debido a la conformación del ADN dependiente de la secuencia o la conformación del ADN creada por otras NAP. ^[18]

Aunque los mecanismos moleculares de cómo las NAP condensan el ADN in vivo no se comprenden bien, según los amplios estudios in vitro, parece que las NAP participan en la compactación cromosómica a través de los siguientes mecanismos: las NAP inducen y estabilizan curvaturas en el ADN, por lo que ayudan a la condensación del ADN al reducir la longitud de persistencia. ^[20] Las NAP condensan el ADN mediante puentes, envolturas y agrupamientos que podrían ocurrir entre segmentos de ADN cercanos o segmentos de ADN distantes del cromosoma. Otro mecanismo por el cual las NAP participan en la compactación cromosómica es restringiendo las superenrollaciones negativas en el ADN, contribuyendo así a la organización topológica del cromosoma. ^[20]

Existen al menos 12 NAP identificados en E. coli, ^[20] de los cuales los más estudiados son HU, IHF, H-NS y Fis. Su abundancia, sus propiedades de unión al ADN y su efecto sobre la condensación y organización del ADN se resumen en las tablas siguientes. ^[20]

¹ Los datos de abundancia (moléculas/célula) se tomaron de; ^[21] El número entre paréntesis es la concentración micromolar calculada utilizando la siguiente fórmula: (número de unidades funcionales nativas/número de Avogadro) x (1/volumen celular en litro) x 10 ³ . El volumen celular en litros (2 x 10 ⁻¹⁵ ) se determinó asumiendo que el volumen de la célula de E. coli era de 2 μm ³ . ^[21]

¹ La afinidad de unión se refiere a la constante de disociación de equilibrio (Kd) en unidades molares (M). ND = no determinado

Hungaro

La proteína similar a histona de la cepa U93 de E. coli (HU) es una proteína conservada evolutivamente en bacterias. ^{[33] [34]} HU existe en E. coli como homo y heterodímeros de dos subunidades HUα y HUβ que comparten una identidad de aminoácidos del 69%. ^[35] Aunque se la conoce como una proteína similar a histona, los parientes funcionales cercanos de HU en eucariotas son las proteínas del grupo de alta movilidad (HMG), y no las histonas. ^{[36] [37]} HU es una proteína de unión al ADN no específica de secuencia. Se une con baja afinidad a cualquier ADN lineal. Sin embargo, se une preferentemente con alta afinidad a un ADN estructuralmente distorsionado. ^{[38] [39] [40] [41] [42] [24]} Los ejemplos de sustratos de ADN distorsionados incluyen ADN cruciforme , ADN abultado, ADNdc que contiene una rotura monocatenaria como mellas , huecos o horquillas . Además, HU se une específicamente y estabiliza un bucle de ADN mediado por proteínas. ^[43] En el modo de unión de ADN estructuralmente específico, HU reconoce un motivo estructural común definido por curvas o torceduras creadas por distorsión, ^{[22] [44] [23]} mientras que se une a un ADN lineal bloqueando la cadena principal de fosfato. ^[45] Si bien la unión estructuralmente específica de alta afinidad es necesaria para funciones especializadas de HU, como la recombinación específica del sitio , la reparación del ADN , el inicio de la replicación del ADN y la regulación genética, ^{[9] [10] [11]} parece que la unión general de baja afinidad está involucrada en la condensación del ADN. ^[45] En la inmunoprecipitación de cromatina acoplada a la secuenciación de ADN ( ChIP-Seq ), HU no revela ningún evento de unión específico. ^[46] En cambio, muestra una unión uniforme en todo el genoma que presumiblemente refleja su unión mayoritariamente débil y no específica de la secuencia, enmascarando así la unión de alta afinidad in vivo . ^[46]

En cepas que carecen de HU, el nucleoide está "descondensado", lo que es coherente con el papel de la HU en la compactación del ADN. ^[47] Los siguientes estudios in vitro sugieren posibles mecanismos de cómo la HU podría condensar y organizar el ADN in vivo . La HU no solo se une de forma estable al ADN distorsionado con curvas, sino que induce curvas flexibles incluso en un ADN lineal a una concentración inferior a 100 nM. Por el contrario, la HU muestra el efecto arquitectónico opuesto en el ADN a concentraciones fisiológicamente relevantes más altas. ^{[45] [9] [10] [11] [47] [48]} Forma filamentos de nucleoproteína rígidos que provocan el enderezamiento del ADN y no la curvatura. Los filamentos pueden formar además una red de ADN (agrupamiento de ADN) expansible tanto lateral como medialmente debido a la multimerización HU-HU desencadenada por la unión al ADN no específica de la secuencia. ^[45]

¿Cómo son relevantes estos comportamientos de HU dentro de la célula? La formación de filamentos requiere una unión de alta densidad de HU en el ADN, un dímero de HU por cada 9-20 pb de ADN. Pero solo hay un dímero de HU cada ~150 pb del ADN cromosómico basado en la abundancia estimada de 30.000 dímeros de HU por célula (4600000 pb /30.000). ^[21] Esto indica que es más probable que las curvas flexibles ocurran in vivo . La curvatura flexible causaría condensación debido a una reducción en la longitud de persistencia del ADN como lo muestran los experimentos con pinzas magnéticas , que permiten estudiar la condensación de una sola molécula de ADN por una proteína de unión al ADN. ^{[48] [49]} Sin embargo, debido a la cooperatividad , los filamentos y redes rígidos podrían formarse en algunas regiones del cromosoma. La formación de filamentos por sí sola no induce condensación, ^[48] pero la formación de redes o agrupamiento de ADN puede contribuir sustancialmente a la condensación al unir segmentos cromosómicos distantes o cercanos. ^[45]

Ocupación de todo el genoma de las proteínas asociadas a nucleoides de E. coli . Disposición circular del genoma de E. coli que muestra la ocupación de todo el genoma de las NAP Fis, H-NS, HU e IHF en las fases de crecimiento y estacionaria en E. coli . Los gráficos de histograma de la ocupación del genoma de las NAP, determinada por inmunoprecipitación de cromatina acoplada a secuenciación de ADN (ChIP-seq), se muestran fuera del genoma circular. El tamaño de bin de los histogramas es de 300 pb. Figura preparada en circos/0.69-6 utilizando los datos de ChIP-Seq de. ^{[46] [50]}

Fiebre del oro internacional

El factor de integración del huésped (IHF) es estructuralmente casi idéntico al HU ^[51] pero se comporta de manera diferente al HU en muchos aspectos. A diferencia del HU, que se une preferentemente a un motivo estructural independientemente de la secuencia, el IHF se une preferentemente a una secuencia de ADN específica, aunque la especificidad surge a través de la estructura y deformabilidad del ADN dependiente de la secuencia. La unión específica del IHF en sitios cognados dobla el ADN bruscamente en >160 grados. ^[51] Una ocurrencia del motivo de secuencia cognada es de aproximadamente 3000 en el genoma de E. coli . ^[46] La abundancia estimada de IHF en la fase de crecimiento es de aproximadamente 6000 dímeros por célula. Suponiendo que un dímero de IHF se une a un solo motivo y el nucleoide contiene más de un equivalente del genoma durante la fase de crecimiento exponencial, la mayoría de las moléculas de IHF ocuparían sitios específicos en el genoma y probablemente solo condensarían el ADN induciendo una curvatura brusca. ^[46]

Además de la unión preferencial a una secuencia de ADN específica, el IHF también se une al ADN de una manera no específica de la secuencia con afinidades similares a HU. Un papel de la unión no específica de IHF en la condensación del ADN parece ser crítico en la fase estacionaria porque la abundancia de IHF aumenta cinco veces en la fase estacionaria y los dímeros de IHF adicionales probablemente se unirían al ADN cromosómico de manera no específica. ^{[21] [52] [53]} A diferencia de HU, IHF no forma filamentos rígidos gruesos a concentraciones más altas. En cambio, su unión no específica también induce la flexión del ADN, aunque el grado de flexión es mucho menor que en sitios específicos y es similar a la flexión flexible inducida por HU en un ADN lineal a bajas concentraciones. ^[54] In vitro , la flexión inducida por la unión no específica de IHF puede causar condensación de ADN y promueve la formación de complejos de nucleoproteínas de orden superior dependiendo de las concentraciones de cloruro de potasio y cloruro de magnesio. ^[54] La organización del ADN de orden superior por IHF in vivo aún no está clara. ^[54]

H-NS

Una característica distintiva de la proteína estructurante de nucleoides termoestable o similar a histona (H-NS) ^{[55] [56] [57] [58]} de otras NAP es la capacidad de cambiar de la forma homodímera en concentraciones relativamente bajas (<1 x 10 ⁻⁵ M) a un estado oligomérico en niveles más altos. ^{[59] [60]} Debido a las propiedades de oligomerización, la H-NS se propaga lateralmente a lo largo del ADN rico en AT en una reacción de nucleación , donde los sitios de alta afinidad funcionan como centros de nucleación. ^{[61] [62] [28]} La propagación de la H-NS en el ADN da como resultado dos resultados opuestos dependiendo de la concentración de magnesio en la reacción. A baja concentración de magnesio (< 2 mM), la H-NS forma filamentos de nucleoproteína rígidos mientras que forma puentes intermoleculares e intramoleculares a concentraciones de magnesio más altas (> 5 mM). ^{[63] [64] [65] [66] [67]} La ​​formación de filamentos rígidos da como resultado el enderezamiento del ADN sin condensación, mientras que el puente causa un plegamiento sustancial del ADN. ^[66] El análisis de la unión de H-NS en el genoma mediante ensayos ChIP-Seq proporcionó evidencia indirecta de la propagación de H-NS en el ADN in vivo . H-NS se une selectivamente a 458 regiones en el genoma. ^[50] Aunque se ha demostrado que H-NS prefiere el ADN curvado formado por pistas A repetidas en secuencias de ADN ^{[61] [68]} la base de la unión selectiva es la presencia de un motivo de secuencia conservado que se encuentra en regiones ricas en AT. ^[27] Más importante aún, la aparición frecuente del motivo de secuencia dentro de una región de unión de H-NS que puede reforzar las interacciones cooperativas proteína-proteína, y la longitud inusualmente larga de la región de unión son consistentes con la propagación de la proteína. Si la formación de filamentos o el puente de ADN prevalecen in vivo depende de la concentración fisiológica de magnesio dentro de la célula. ^{[66] [69]} Si la concentración de magnesio es uniformemente baja (< 5 mM), H-NS formaría filamentos de nucleoproteína rígidos in vivo . ^[66] Alternativamente, si hay una distribución desigual de magnesio en la célula, podría promover tanto la unión como el endurecimiento del ADN, pero en diferentes regiones del nucleoide. ^[66]

Además, la H-NS es más conocida como un silenciador génico global que inhibe preferentemente la transcripción de genes transferidos horizontalmente y es el filamento rígido el que conduce al silenciamiento génico. ^{[70] [71]} En conjunto, parece que la formación de filamentos rígidos es el resultado más probable de las interacciones H-NS-ADN in vivo que conduce al silenciamiento génico pero no induce la condensación del ADN. De manera consistente, la ausencia de H-NS no cambia el volumen del nucleoide. ^[72] Sin embargo, es posible que E. coli experimente una alta concentración de magnesio en algunas condiciones ambientales. En tales condiciones, la H-NS puede cambiar de su forma inductora de filamentos a la forma inductora de puentes que contribuye a la condensación y organización del ADN. ^[66]

Pez

Factor for Inversion Stimulation (Fis) es una proteína de unión a ADN específica de secuencia que se une a secuencias de ADN específicas que contienen un motivo simétrico de 15 pb. ^{[29] [30] [73]} Al igual que IHF, Fis induce la flexión del ADN en sitios cognados. La capacidad de doblar el ADN es evidente en la estructura del homodímero Fis. Un homodímero Fis posee dos motivos hélice-giro-hélice (HTH), uno de cada monómero. Un motivo HTH generalmente reconoce el surco principal del ADN. Sin embargo, la distancia entre las hélices de reconocimiento de ADN de los dos motivos HTH en el homodímero Fis es de 25 Å , es decir, ~ 8 Å más corta que el paso de un B-ADN canónico , lo que indica que la proteína debe doblar o torcer el ADN para unirse de manera estable. ^{[74] [75]} De manera consistente, la estructura cristalina de los complejos Fis-ADN muestra que la distancia entre las hélices de reconocimiento permanece inalterada mientras que el ADN se curva en el rango de 60-75 grados. ^[30] Hay 1464 regiones de unión de Fis distribuidas en el genoma de E. coli y un motivo de unión, identificado computacionalmente, coincide con el motivo conocido de 15 pb. ^{[50] [76]} La unión específica de Fis en dichos sitios induciría curvaturas en el ADN, contribuyendo así a la condensación del ADN al reducir la longitud de persistencia del ADN. Además, muchos sitios de unión de Fis ocurren en tándem, como aquellos en los promotores de ARN estables, por ejemplo, el promotor P1 del operón de ARNr rrnB . Es probable que la curvatura coherente de Fis en los sitios en tándem cree un microbucle de ADN que puede contribuir aún más a la condensación del ADN. ^[77]

Además de la unión específica de alta afinidad a sitios cognados, Fis puede unirse a una secuencia de ADN aleatoria. La unión no específica al ADN es significativa porque Fis es tan abundante como HU en la fase de crecimiento . Por lo tanto, se espera que la mayoría de las moléculas de Fis se unan al ADN de una manera no específica de la secuencia. Los experimentos con pinzas magnéticas muestran que esta unión no específica de Fis puede contribuir a la condensación y organización del ADN. ^{[78] [79]} Fis causa una condensación leve de una sola molécula de ADN a <1 mM, pero induce un plegamiento sustancial a través de la formación de bucles de ADN de un tamaño promedio de ~800 pb a >1 mM. Los bucles en los experimentos con pinzas magnéticas son distintos de los microbucles creados por la flexión coherente del ADN en sitios cognados, ya que requieren la formación de complejos de proteína-ADN de alta densidad logrados por la unión independiente de la secuencia. Aunque aún queda por demostrar la aparición de tales bucles in vivo , la unión de alta densidad de Fis puede ocurrir in vivo a través de la acción concertada de la unión específica y no específica. La aparición en tándem de sitios específicos podría iniciar una reacción de nucleación similar a la de H-NS, y luego la unión no específica conduciría a la formación de matrices localizadas de alta densidad de Fis. La unión entre estas regiones localizadas puede crear grandes bucles de ADN. ^[79] Fis está presente exclusivamente en la fase de crecimiento y no en la fase estacionaria . ^{[80] [81]} Por lo tanto, cualquier papel en la condensación cromosómica por Fis debe ser específico para las células en crecimiento. ^[81]

ARN asociados a nucleoides (ARNna)

Los primeros estudios que examinaron el efecto del tratamiento con ARNasa A en nucleoides aislados indicaron que el ARN participó en la estabilización del nucleoide en el estado condensado. ^[82] Además, el tratamiento con ARNasa A rompió las fibras de ADN en fibras más delgadas, como se observó mediante una microscopía de fuerza atómica del nucleoide utilizando el "procedimiento de lisis sobre sustrato". ^[83] Estos hallazgos demostraron la participación del ARN en la estructura del nucleoide, pero la identidad de la(s) molécula(s) de ARN permaneció desconocida hasta hace poco. ^[47] La ​​mayoría de los estudios sobre HU se centraron en su unión al ADN. ^[83] Sin embargo, HU también se une a dsRNA e híbridos ARN-ADN con una afinidad menor similar a la de un dsADN lineal. ^[84] Además, HU se une preferentemente al ARN que contiene estructuras secundarias y a un híbrido ARN-ADN en el que el ARN contiene una mella o saliente. ^{[84] [85]} Las afinidades de unión de HU con estos sustratos de ARN son similares a aquellas con las que se une al ADN distorsionado. Un estudio de inmunoprecipitación de ARN unido a HU acoplado a transcripción inversa y microarray (RIP-Chip), así como un análisis de ARN de nucleoides intactos purificados, identificaron moléculas de ARN asociadas a nucleoides que interactúan con HU. ^[47] Varios de ellos son ARN no codificantes, y uno de esos ARN llamado naRNA4 (ARN asociado a nucleoide 4), está codificado en un palíndromo extragénico repetitivo ( REP325 ). En una cepa que carece de REP325 , el nucleoide se descondensa como en una cepa que carece de HU. ^[47] Es muy probable que naRNA4 participe en la condensación del ADN conectando segmentos de ADN en presencia de HU. ^[86] Estudios recientes proporcionan información sobre el mecanismo molecular de cómo naRNA4 establece conexiones ADN-ADN. El ARN se dirige a regiones de ADN que contienen estructuras cruciformes y forma un complejo ARN-ADN que es fundamental para establecer conexiones ADN-ADN. ^[87] Sorprendentemente, aunque la HU ayuda en la formación del complejo, no está presente en el complejo final, lo que indica su papel potencial como catalizador (chaperona). La naturaleza del complejo ARN-ADN sigue siendo desconcertante porque la formación del complejo no implica un extenso emparejamiento de bases Watson/Crick, sino que es sensible a la ARNasa H, que escinde el ARN en un híbrido ARN-ADN y el complejo se une a un anticuerpo específico para los híbridos ARN-ADN. ^{[47] [83] [84]}

Superenrollamiento

Superenrollamiento del ADN A. Un ADN bicatenario lineal se convierte en una molécula topológicamente restringida si los dos extremos se unen covalentemente, formando un círculo. Las reglas de la topología del ADN se explican utilizando una molécula de este tipo (ADN ccc) en la que un parámetro numérico llamado número de enlace (Lk) define la topología. Lk es una suma matemática de dos parámetros geométricos, torsión (Tw) y contorsión (Wr). Una torsión es el cruce de dos hebras, y la contorsión es el enrollamiento de la doble hélice de ADN sobre su eje que requiere curvatura. Lk es siempre un número entero y permanece invariable sin importar cuánto se deformen las dos hebras. Solo se puede cambiar introduciendo una ruptura en una o ambas hebras de ADN por enzimas metabólicas del ADN llamadas topoisomerasas. B. Una tensión torsional creada por un cambio en Lk de un ADN relajado y topológicamente restringido se manifiesta en forma de superenrollamiento del ADN. Una disminución de Lk (Lk<Lk ₀ ) induce un superenrollamiento negativo, mientras que un aumento de Lk (Lk>Lk ₀ ) induce un superenrollamiento positivo. Aquí solo se representa el superenrollamiento negativo. Por ejemplo, si se introduce un corte en un ADN ccc y se eliminan cuatro vueltas antes de volver a unir las dos hebras, el ADN se superenrolla negativamente con una disminución en el número de vueltas o retorcimientos o ambos. El retorcimiento puede adoptar dos tipos de estructuras geométricas llamadas plectonema y toroide. Los plectonemas se caracterizan por el entrelazado de la doble hélice de ADN y un bucle apical, mientras que la espiralización de la doble hélice de ADN alrededor de un eje forma toroides.

Debido a su estructura helicoidal , una molécula de ADN de doble cadena se restringe topológicamente en la forma circular cerrada covalentemente que elimina la rotación de los extremos libres. ^[88] El número de veces que las dos cadenas se cruzan entre sí en un ADN topológicamente restringido se denomina número de enlace (Lk), que es equivalente al número de vueltas o giros helicoidales en una molécula circular. ^[89] El Lk de un ADN topológico permanece invariable, sin importar cómo se deforme la molécula de ADN, siempre y cuando ninguna de las cadenas se rompa. ^{[90] [91]}

El Lk del ADN en la forma relajada se define como Lk ₀ . Para cualquier ADN, Lk ₀ se puede calcular dividiendo la longitud (en pb) del ADN por el número de pb por vuelta helicoidal. Esto es igual a 10,4 pb para el ADN en forma B relajada . Cualquier desviación de Lk ₀ provoca superenrollamiento en el ADN. Una disminución en el número de enlace (Lk<Lk ₀ ) crea un superenrollamiento negativo, mientras que un aumento en el número de enlace (Lk>Lk ₀ ) crea un superenrollamiento positivo. ^{[92] [90]}

El estado superenrollado (cuando Lk no es igual a Lk ₀ ) da como resultado una transición en la estructura del ADN que puede manifestarse como un cambio en el número de giros (negativo <10,4 pb/giro, positivo >10,4 pb por giro) y/o en la formación de retorcimientos , llamados superenrollamientos. Por lo tanto, Lk se define matemáticamente como una suma dependiente del signo de los dos parámetros geométricos, giro y retorcimiento. Una medida cuantitativa del superenrollamiento que es independiente del tamaño de las moléculas de ADN es la densidad de superenrollamiento (σ) donde σ =∆Lk/Lk ₀ . ^[91]

Las superenrollaciones pueden adoptar dos estructuras: plectonema y solenoide o toroide. Una estructura plectonémica surge del entrelazamiento del eje helicoidal. Las superenrollaciones toroidales se originan cuando el ADN forma varias espirales, alrededor de un eje y sin intersectarse entre sí, como las de un cable telefónico. ^[90] Las superenrollaciones en forma de plectonemas son dextrógiras y levógiras en el ADN superenrollado positiva o negativamente, respectivamente. La lateralidad de las superenrollaciones toroidales es opuesta a la de los plectonemas. Tanto los plectonemas como las superenrollaciones toroidales pueden estar en forma libre o restringidas en forma ligada con proteínas. El mejor ejemplo de superenrollamiento toroidal ligado en biología es el nucleosoma eucariota en el que el ADN se enrolla alrededor de las histonas . ^[17]

Superenrollamientos plectonémicos enE. coli

Unidades básicas de organización genómica en bacterias y eucariotas El ADN genómico, representado como una línea gris, está superenrollado negativamente tanto en bacterias como en eucariotas. Sin embargo, el ADN superenrollado negativamente está organizado en forma plectonémica en bacterias, mientras que está organizado en forma toroidal en eucariotas. Las proteínas asociadas a nucleoides (NAP), mostradas como esferas coloreadas, restringen la mitad de las superenrollaciones plectonémicas, mientras que casi todas las superenrollaciones toroidales son inducidas y restringidas por nucleosomas (coloreados en naranja), formados por el envoltorio de ADN alrededor de histonas.

En la mayoría de las bacterias, el ADN está presente en forma superenrollada. La naturaleza circular del cromosoma de E. coli lo convierte en una molécula topológicamente restringida que está mayoritariamente superenrollada negativamente con una densidad de superenrollamiento promedio estimada (σ) de -0,05. ^{[93] En la} cromatina eucariota , el ADN se encuentra principalmente en la forma toroidal que está restringida y definida por histonas a través de la formación de nucleosomas. Por el contrario, en el nucleoide de E. coli , aproximadamente la mitad del ADN cromosómico está organizado en forma de superenrollamientos plectonémicos libres. ^{[94] [95] [96]} El ADN restante está restringido en la forma plectonémica o formas alternativas, incluyendo pero no limitado a la forma toroidal, por interacción con proteínas como las NAP. Por lo tanto, los superenrollamientos plectonémicos representan un superenrollamiento efectivo del genoma de E. coli que es responsable de su condensación y organización. Tanto el superenrollamiento plectonémico como el toroidal ayudan en la condensación del ADN. La ramificación de las estructuras plectonémicas proporciona una menor condensación del ADN que la estructura toroidal. Una molécula de ADN del mismo tamaño con densidades de superenrollamiento iguales es más compacta en una forma toroidal que en una forma plectonémica. Además de condensar el ADN, el superenrollamiento ayuda a la organización del ADN. Promueve el desenredo del ADN al reducir la probabilidad de concatenación. ^[97] El superenrollamiento también ayuda a acercar dos sitios distantes del ADN, promoviendo así una posible interacción funcional entre diferentes segmentos del ADN. ^[91]

Fuentes de superenrollamiento enE. coli

Tres factores contribuyen a generar y mantener el superenrollamiento del ADN cromosómico en E. coli : (i) las actividades de las topoisomerasas , (ii) el acto de transcripción y (iii) las NAP. ^[95]

Topoisomerasas

Las topoisomerasas son una categoría particular de enzimas metabólicas del ADN que crean o eliminan el superenrollamiento rompiendo y luego volviendo a ligar las cadenas de ADN. ^[98] E. coli posee cuatro topoisomerasas. La ADN girasa introduce un superenrollamiento negativo en presencia de ATP y elimina el superenrollamiento positivo en ausencia de ATP. ^[99] En todas las formas de vida, la ADN girasa es la única topoisomerasa que puede crear un superenrollamiento negativo y es debido a esta capacidad única que los genomas bacterianos poseen superenrollamientos negativos libres; la ADN girasa se encuentra en todas las bacterias pero está ausente en los eucariotas superiores. Por el contrario, la Topo I se opone a la ADN girasa relajando el ADN superenrollado negativamente. ^{[100] [101]} Existe evidencia genética que sugiere que un equilibrio entre las actividades opuestas de la ADN girasa y la Topo I son responsables de mantener un nivel de estado estable de superhelicidad negativa promedio en E. coli . ^{[100] [102]} Ambas enzimas son esenciales para la supervivencia de E. coli . Una cepa nula de topA , el gen que codifica Topo I, sobrevive sólo debido a la presencia de mutaciones supresoras en los genes que codifican la ADN girasa. ^{[100] [102]} Estas mutaciones dan como resultado una actividad reducida de la girasa, lo que sugiere que el exceso de superenrollamiento negativo debido a la ausencia de Topo I se compensa con una actividad reducida de superenrollamiento negativo de la ADN girasa. Topo III es prescindible en E. coli y no se sabe que tenga ningún papel en el superenrollamiento en E. coli. ^[103] La función principal de Topo IV es resolver los cromosomas hermanos. Sin embargo, se ha demostrado que también contribuye al nivel de estado estable de superenrollamiento negativo al relajar el superenrollamiento negativo junto con Topo I. ^{[104] [105]}

Transcripción

Un modelo de dominio de superenrollamiento gemelo propuesto por Liu y Wang argumentó que el desenrollado de la doble hélice de ADN durante la transcripción induce superenrollamiento en el ADN como se muestra en. ^[106] Según su modelo, la ARN polimerasa transcripcional (RNAP) que se desliza a lo largo del ADN obliga al ADN a rotar sobre su eje helicoidal. Un obstáculo en la rotación libre del ADN podría surgir debido a una restricción topológica, haciendo que el ADN delante de la ARN polimerasa se tuerza demasiado (superenrollado positivamente) y el ADN detrás de la ARN polimerasa se tuerza poco (superenrollado negativamente). Se ha descubierto que no se necesita una restricción topológica porque la ARN polimerasa genera suficiente torque que causa superenrollamiento incluso en una plantilla de ADN lineal. ^[107] Si el ADN ya está superenrollado negativamente, esta acción relaja las superenrollaciones negativas existentes antes de causar una acumulación de superenrollamientos positivos delante de la ARN polimerasa e introduce más superenrollamientos negativos detrás de la ARN polimerasa. En principio, la ADN girasa y la Topo I deberían eliminar el exceso de superenrollamientos positivos y negativos respectivamente, pero si la tasa de elongación de la ARN polimerasa excede el recambio de las dos enzimas, la transcripción contribuye al nivel de estado estable del superenrollamiento. ^[107]

Modelo de dominio de superenrollamiento gemelo para el superenrollamiento inducido por transcripción A. Un ejemplo de ADN topológicamente restringido. Una barra gris representa una restricción topológica, p. ej. una proteína o un ancla de membrana. B. La acomodación de la ARN polimerasa para la iniciación de la transcripción da como resultado la apertura de la doble hélice del ADN. C. Un complejo de ARN polimerasa en elongación no puede rotar alrededor del eje helicoidal del ADN. Por lo tanto, la eliminación de los giros helicoidales por la ARN polimerasa causa un sobreenrollamiento del ADN topológicamente restringido por delante y un subenrollamiento del ADN por detrás, generando ADN superenrollado positiva y negativamente, respectivamente. El superenrollamiento puede manifestarse como un cambio en el número de giros como se muestra en C o como una contorsión plectonémica como se muestra en D.

Control del superenrollamiento por NAP

En la cromatina eucariota, el ADN rara vez está presente en la forma superenrollada libre porque los nucleosomas restringen casi todo superenrollamiento negativo a través de la unión fuerte del ADN a las histonas. De manera similar, en E. coli , los complejos de nucleoproteína formados por NAP restringen la mitad de la densidad de superenrollamiento del nucleoide. ^{[93] [96]} En otras palabras, si un NAP se disocia de un complejo de nucleoproteína , el ADN adoptaría la forma libre, plectonémica. Se ha demostrado experimentalmente que la unión al ADN de HU, Fis y H-NS restringe el superenrollamiento negativo en un ADN relajado pero topológicamente restringido. ^{[108] [109] [110] [111] [112]} Pueden hacerlo ya sea cambiando el paso helicoidal del ADN o generando retorcimientos toroidales mediante la flexión y envoltura del ADN. Como alternativa, las NAP pueden unirse preferentemente a otras formas del ADN enrollado, como las estructuras cruciformes y los plectonemas ramificados, y estabilizarlas. Se ha informado que Fis organiza los plectonemas ramificados mediante su unión a las regiones de cruce y que HU se une preferentemente a las estructuras cruciformes. ^[112]

Las NAP también regulan indirectamente el superenrollamiento del ADN. Fis puede modular el superenrollamiento reprimiendo la transcripción de los genes que codifican la ADN girasa. ^[113] Hay evidencia genética que sugiere que HU controla los niveles de superenrollamiento estimulando la ADN girasa y reduciendo la actividad de Topo I. ^{[114] [115]} En apoyo de los estudios genéticos, se demostró que HU estimula la decatenación del ADN catalizada por la ADN girasa in vitro . ^[116] No está claro mecanísticamente cómo HU modula las actividades de la girasa y Topo I. HU podría interactuar físicamente con la ADN girasa y Topo I o las actividades de organización del ADN de HU, como la flexión del ADN, pueden facilitar o inhibir la acción de la ADN girasa y Topo I respectivamente. ^{[114] [116]}

Las superbobinas plectonémicas se organizan en múltiples dominios topológicos

Una de las características sorprendentes del nucleoide es que las superenrollaciones plectonémicas están organizadas en múltiples dominios topológicos. ^[117] En otras palabras, un solo corte en un dominio solo relajará ese dominio y no los demás. Un dominio topológico se forma debido a una barrera de superenrollamiento-difusión. Estudios independientes que emplean diferentes métodos han informado que los dominios topológicos son de tamaño variable que van desde 10 a 400 kb. ^{[95] [117] [118]} Una colocación aleatoria de barreras observada comúnmente en estos estudios parece explicar la amplia variabilidad en el tamaño de los dominios. ^[117]

Aunque aún quedan por establecer las identidades de las barreras de dominio, los posibles mecanismos responsables de la formación de las barreras incluyen: (i) Una barrera de dominio podría formarse cuando una proteína con una capacidad para restringir superenrollamientos se une simultáneamente a dos sitios distintos en el cromosoma formando un bucle o dominio de ADN topológicamente aislado. Se ha demostrado experimentalmente que el bucle mediado por proteínas en ADN superenrollado puede crear un dominio topológico. ^{[119] [120]} Los NAP como H-NS y Fis son candidatos potenciales, en función de sus capacidades de bucle de ADN y la distribución de sus sitios de unión. (ii) Los elementos de mosaico intercalados bacterianos (BIME) también aparecen como candidatos potenciales para las barreras de dominio. Los BIME son secuencias de repeticiones palindrómicas que generalmente se encuentran entre genes. Se ha demostrado que un BIME impide la difusión del superenrollamiento en un casete topológico diseñado sintéticamente insertado en el cromosoma de E. coli . ^[121] Existen aproximadamente 600 BIME distribuidos en el genoma, que posiblemente dividan el cromosoma en 600 dominios topológicos. ^[122] (iii) Las barreras también podrían resultar de la unión del ADN a la membrana celular a través de una proteína que se une tanto al ADN como a la membrana o a través de la transcripción naciente y la traducción de proteínas ancladas a la membrana. (iv) La actividad de transcripción puede generar barreras de superenrollamiento-difusión. Se ha demostrado que una ARN polimerasa que se transcribe activamente bloquea la disipación de superenrollamientos plectonémicos, formando así una barrera de superenrollamiento-difusión. ^{[123] [124] [125]}

El ADN cromosómico dentro del nucleoide se segrega en dominios topológicos superenrollados independientes A. Una ilustración de un solo dominio topológico de un ADN superenrollado. Un solo corte de doble cadena en cualquier lugar sería suficiente para relajar la tensión de superenrollamiento de todo el dominio. B. Una ilustración de múltiples dominios topológicos en una molécula de ADN superenrollada. La presencia de barreras de superenrollamiento-difusión segrega una molécula de ADN superenrollada en múltiples dominios topológicos. Las barreras de difusión de superenrollamiento hipotéticas se representan como esferas verdes. Como resultado, un solo corte de doble cadena solo relajará un dominio topológico y no los demás. Los superenrollamientos plectonémicos de ADN dentro del nucleoide de E. coli están organizados en varios dominios topológicos, pero solo se muestran cuatro dominios con un número diferente de superenrollamientos para simplificar.

Dinámica de nucleoides dependiente de la fase de crecimiento

El nucleoide se reorganiza en las células en fase estacionaria, lo que sugiere que la estructura del nucleoide es altamente dinámica, determinada por el estado fisiológico de las células. Una comparación de los mapas de contacto de alta resolución del nucleoide reveló que los contactos de largo alcance en el macrodominio Ter aumentaron en la fase estacionaria , en comparación con la fase de crecimiento . ^[126] Además, los límites de CID en la fase estacionaria fueron diferentes de los encontrados en la fase de crecimiento. Finalmente, la morfología del nucleoide sufre una transformación masiva durante la fase estacionaria prolongada; ^[127] el nucleoide exhibe estructuras toroidales ordenadas. ^[128]

Los cambios específicos de la fase de crecimiento en la estructura del nucleoide podrían ser provocados por un cambio en los niveles de proteínas arquitectónicas del ADN asociadas al nucleoide (las NAP y las subunidades Muk), el superenrollamiento y la actividad de transcripción. La abundancia de NAP y las subunidades Muk cambia según el ciclo de crecimiento bacteriano. Fis y la proteína de unión al ADN inducida por la inanición Dps, otra NAP, están presentes casi exclusivamente en la fase de crecimiento y la fase estacionaria respectivamente. Los niveles de Fis aumentan al entrar en la fase exponencial y luego disminuyen rápidamente mientras las células aún están en la fase exponencial, alcanzando niveles que son indetectables en la fase estacionaria. ^[129] Mientras que los niveles de Fis comienzan a disminuir, los niveles de Dps comienzan a aumentar y alcanzan un máximo en la fase estacionaria. ^[21] Una transición dramática en la estructura del nucleoide observada en la fase estacionaria prolongada se ha atribuido principalmente a Dps. Forma conjuntos de ADN/ cristalino que actúan para proteger al nucleoide de los agentes dañinos del ADN presentes durante la inanición. ^[128]

HU, IHF y H-NS están presentes tanto en la fase de crecimiento como en la fase estacionaria. ^[21] Sin embargo, su abundancia cambia significativamente de modo que HU y Fis son las NAP más abundantes en la fase de crecimiento, mientras que IHF y Dps se convierten en las NAP más abundantes en la fase estacionaria. ^[21] HUαα es la forma predominante en la fase exponencial temprana, mientras que la forma heterodímera predomina en la fase estacionaria, con cantidades menores de homodímeros. ^[130] Esta transición tiene consecuencias funcionales con respecto a la estructura del nucleoide, porque las dos formas parecen organizar y condensar el ADN de manera diferente; tanto los homo- como los heterodímeros forman filamentos, pero solo el homodímero puede unir múltiples segmentos de ADN para formar una red de ADN. ^[45] El número de copias de MukB aumenta al doble en la fase estacionaria. ^{[131] [132]} Un aumento en el número de moléculas de MukB podría tener influencia en la procesividad del complejo MukBEF como un factor de extrusión de bucles de ADN, lo que da como resultado un mayor número de bucles. ^{[131] [132]}

El superenrollamiento puede actuar de manera concertada con las proteínas arquitecturales del ADN para reorganizar el nucleoide. El nivel general de superenrollamiento disminuye en la fase estacionaria, y el superenrollamiento exhibe un patrón diferente a nivel regional. ^[133] Los cambios en el superenrollamiento pueden alterar la organización topológica del nucleoide. Además, debido a que una región cromosómica de alta actividad de transcripción forma un límite CID, los cambios en la actividad de transcripción durante diferentes fases de crecimiento podrían alterar la formación de límites CID y, por lo tanto, la organización espacial del nucleoide. Es posible que los cambios en los límites CID observados en la fase estacionaria se deban a la alta expresión de un conjunto diferente de genes en la fase estacionaria en comparación con la fase de crecimiento. ^[126]

Estructura del nucleoide y expresión génica

Los NAP y la expresión genética

La estructura cromosómica de E. coli y la expresión génica parecen influirse mutuamente de forma recíproca. Por un lado, una correlación de un límite CID con una alta actividad de transcripción indica que la organización cromosómica está impulsada por la transcripción. Por otro lado, la estructura 3D del ADN dentro del nucleoide en cada escala puede estar vinculada a la expresión génica. En primer lugar, se ha demostrado que la reorganización de la arquitectura 3D del nucleoide en E. coli puede modular dinámicamente el patrón de transcripción celular. ^[134] Un mutante de HUa hizo que el nucleoide se condensara mucho mediante el aumento de la superhelicidad positiva del ADN cromosómico. En consecuencia, muchos genes fueron reprimidos y se expresaron muchos genes inactivos. Además, hay muchos casos específicos en los que los cambios arquitectónicos locales mediados por proteínas alteran la transcripción génica. Por ejemplo, la formación de filamentos nucleoproteínicos rígidos por H-NS bloquea el acceso de la ARN polimerasa al promotor, lo que impide la transcripción génica. ^[135] A través del silenciamiento génico, H-NS actúa como un represor global que inhibe preferentemente la transcripción de genes transferidos horizontalmente. ^{[50] [27]} En otro ejemplo, la unión específica de HU en el operón gal facilita la formación de un bucle de ADN que mantiene al operón gal reprimido en ausencia del inductor. ^[136] El microbucle de ADN topológicamente distinto creado por la flexión coherente del ADN por Fis en promotores de ARN estables activa la transcripción. ^[77] La ​​flexión del ADN por IHF controla de forma diferencial la transcripción de los dos promotores en tándem del operón ilvGMEDA en E. coli . ^{[137] [138]} Los cambios topológicos específicos de los NAP no solo regulan la transcripción génica, sino que también están involucrados en otros procesos como la iniciación de la replicación del ADN, la recombinación y la transposición. ^{[9] [10] [11]} A diferencia de la regulación génica específica, aún queda por resolver cómo la estructura cromosómica de orden superior y su dinámica influyen en la expresión génica a nivel molecular a nivel global. ^[139]

Superenrollamiento del ADN y expresión genética

Existe una interconexión bidireccional entre el superenrollamiento del ADN y la transcripción génica. ^[139] El superenrollamiento negativo de la región promotora puede estimular la transcripción al facilitar la fusión del promotor y al aumentar la afinidad de unión al ADN de un regulador proteico. Las ráfagas estocásticas de transcripción parecen ser una característica general de los genes altamente expresados, y los niveles de superenrollamiento de la plantilla de ADN contribuyen a la explosión transcripcional. ^[140] Según el modelo de dominio de superenrollamiento gemelo, la transcripción de un gen puede influir en la transcripción de otros genes cercanos a través de un relé de superenrollamiento. Un ejemplo de ello es la activación del promotor leu-500 . ^[139] El superenrollamiento no solo media cambios específicos de genes, sino que también media cambios a gran escala en la expresión génica. La organización topológica del nucleoide podría permitir la expresión independiente de genes sensibles al superenrollamiento en diferentes dominios topológicos. Un mapa a escala del genoma del superenrollamiento sin restricciones mostró que las regiones genómicas tienen diferentes densidades de superenrollamiento en estado estable, lo que indica que el nivel de superenrollamiento difiere en dominios topológicos individuales. ^[133] Como resultado, un cambio en el superenrollamiento puede resultar en la expresión génica específica del dominio, dependiendo del nivel de superenrollamiento en cada dominio. ^[133]

El efecto del superenrollamiento en la expresión génica puede ser mediado por NAP que influyen directa o indirectamente en el superenrollamiento. El efecto de HU en la expresión génica parece implicar un cambio en el superenrollamiento y quizás una organización del ADN de orden superior. Una correlación positiva entre la unión de la ADN girasa y la regulación positiva de los genes causada por la ausencia de HU sugiere que los cambios en el superenrollamiento son responsables de la expresión diferencial. También se encontró que HU era responsable de un efecto posicional en la expresión génica al aislar las unidades transcripcionales al restringir el superenrollamiento inducido por la transcripción. ^[141] Las mutaciones puntuales en HUa cambiaron drásticamente el perfil de expresión génica de E. coli, alterando su morfología , fisiología y metabolismo . Como resultado, la cepa mutante fue más invasiva de las células de mamíferos. ^{[134] [142]} Este efecto dramático fue concomitante con la compactación del nucleoide y el aumento del superenrollamiento positivo. ^{[45] [143]} La proteína mutante era un octámero, en contraste con el dímero de tipo salvaje. Envuelve el ADN en su superficie de manera diestra, lo que restringe las superenrollaciones positivas a diferencia de la HU de tipo salvaje. ^[143] Estos estudios muestran que las sustituciones de aminoácidos en HU pueden tener un efecto dramático en la estructura del nucleoide, que a su vez resulta en cambios fenotípicos significativos. ^[143]

Dado que MukB y HU han surgido como actores críticos en las interacciones de ADN de largo alcance, valdrá la pena comparar el efecto de cada una de estas dos proteínas en la expresión génica global. ^[144] Aunque HU parece controlar la expresión génica modulando la densidad de superenrollamiento, el mecanismo molecular exacto sigue siendo desconocido y el impacto de MukB en la expresión génica aún debe analizarse. ^{[144] [145]}

Organización espacial

El nucleoide se organiza espacialmente en dominios de interacciones cromosómicas (CID) y macrodominios A. Los métodos de captura de conformación cromosómica (3C) investigan la organización del genoma en 3D cuantificando las interacciones físicas entre loci genómicos que están cerca en el espacio 3D pero que pueden estar lejos en el genoma lineal. Un genoma se reticula con formaldehído para preservar los contactos físicos entre los loci genómicos. Posteriormente, el genoma se digiere con una enzima de restricción. En el siguiente paso, se lleva a cabo una ligadura de ADN en concentraciones de ADN diluidas para favorecer la ligadura intramolecular (entre fragmentos reticulados que se acercan físicamente mediante la organización del genoma en 3D). Una frecuencia de eventos de ligadura entre sitios de ADN distantes refleja una interacción física. En el método 3C, las uniones de ligadura se detectan mediante la amplificación por PCR semicuantitativa en la que la eficiencia de la amplificación es una estimación aproximada del contacto físico por pares entre las regiones genómicas de interés y su frecuencia. El método 3C investiga una interacción física entre dos regiones específicas identificadas a priori, mientras que su versión Hi-C detecta interacciones físicas entre todos los pares posibles de regiones genómicas simultáneamente. En el método Hi-C, los extremos digeridos se rellenan con un adaptador biotinilado antes de la ligadura. Los fragmentos ligados se cortan y luego se enriquecen mediante un pulldown de biotina. Las uniones de ligadura se detectan y cuantifican luego mediante los métodos de secuenciación de próxima generación de extremos emparejados. B. Los datos Hi-C se representan típicamente en forma de una matriz bidimensional en la que el eje x y el eje y representan las coordenadas genómicas. El genoma generalmente se divide en contenedores de un tamaño fijo, por ejemplo, 5 kb. El tamaño de los contenedores define esencialmente la resolución de contacto. Cada entrada en la matriz, m _ij , representa el número de lecturas de secuenciación quimérica asignadas a loci genómicos en los contenedores i y j. Una cuantificación de las lecturas (representada como un mapa de calor) denota la frecuencia relativa de contactos entre los loci genómicos de los bins i y j. Una característica destacada del mapa de calor es una línea diagonal que aparece debido a la interacción física más frecuente entre los loci que están muy cerca uno del otro en el genoma lineal. La intensidad más alejada de la línea diagonal representa la frecuencia relativa de interacción física entre los loci que están muy alejados entre sí en el genoma lineal. Los triángulos de alta intensidad a lo largo de la línea diagonal representan dominios de interacción cromosómica (CID) altamente autointeractuantes que están separados por una región límite que consta de un número menor de interacciones. C. En muchas especies bacterianas, incluida E. coli, parece que los dominios topológicos superenrollados se organizan como CID. El superenrollamiento plectonemico promueve un alto nivel de interacción entre los loci genómicos dentro de un CID, y una región libre de plectonemas (PFR), creada debido a la alta actividad de transcripción, actúa como un límite de CID. Las proteínas asociadas a nucleoides, representadas como círculos cerrados, estabilizan las interacciones mediadas por el superenrollamiento. La ARN polimerasa que transcribe activamente (representada como una esfera verde) en la PFR bloquea la disipación del superenrollamiento entre los dos dominios, actuando así como una barrera de difusión del superenrollamiento. El tamaño de los CID varía entre 30 y 400 kb. Varios triángulos (CID) se fusionan para formar un triángulo más grande que representa un macrodominio. En otras palabras, los CID de un macrodominio interactúan físicamente entre sí con mayor frecuencia que con los CID de un macrodominio vecino o con loci genómicos fuera de ese macrodominio. Un macrodominio puede comprender varios CID. Para simplificar, se muestra un macrodominio que comprende solo dos CID.

Dominios de interacción cromosómica

En los últimos años, la aparición de un método molecular llamado captura de conformación cromosómica (3C) ha permitido estudiar una organización espacial de alta resolución de los cromosomas tanto en bacterias como en eucariotas. ^[146] 3C y su versión que está acoplada con secuenciación profunda (Hi-C) ^[147] determinan la proximidad física, si la hay, entre dos loci genómicos en el espacio 3D. Un mapa de contacto de alta resolución de cromosomas bacterianos, incluido el cromosoma de E. coli, ha revelado que un cromosoma bacteriano está segmentado en muchas regiones altamente autointeractuantes llamadas dominios de interacción cromosómica (CID). ^{[126] [148] [149]} Los CID son equivalentes a los dominios de asociación topológica (TAD) observados en muchos cromosomas eucariotas, ^[150] lo que sugiere que la formación de CID es un fenómeno general de la organización del genoma. Dos características definen a los CID o TAD. En primer lugar, las regiones genómicas de un CID interactúan físicamente entre sí con mayor frecuencia que con las regiones genómicas fuera de ese CID o con las de un CID vecino. En segundo lugar, la presencia de un límite entre los CID que impide las interacciones físicas entre las regiones genómicas de dos CID vecinos. ^[126]

Se encontró que el cromosoma de E. coli consta de 31 CID en la fase de crecimiento. El tamaño de los CID osciló entre 40 y ~300 kb. Parece que una barrera de superenrollamiento-difusión responsable de segregar bucles de ADN plectonémicos en dominios topológicos funciona como un límite de CID en E. coli y muchas otras bacterias. En otras palabras, la presencia de una barrera de superenrollamiento-difusión define la formación de CID. Los hallazgos del sondeo Hi-C de cromosomas en E. coli , Caulobacter crescentus y Bacillus subtilis convergen en un modelo de que los CID se forman porque los bucles plectonémicos junto con las actividades de organización del ADN de las NAP promueven interacciones físicas entre loci genómicos, y un límite de CID consiste en una región libre de plectonemas (PFR) que evita estas interacciones. Un PFR se crea debido a una alta actividad de transcripción porque el desenrollado helicoidal del ADN mediante la transcripción activa de la ARN polimerasa restringe las superenrollaciones plectonémicas. Como resultado, la disipación de las superenrollaciones también se bloquea, creando una barrera de difusión por superenrollamiento. La evidencia indirecta de este modelo proviene de una observación de que los CID de los cromosomas bacterianos, incluido el cromosoma de E. coli, muestran genes altamente transcritos en sus límites, lo que indica un papel de la transcripción en la formación de un límite CID. ^{[126] [148]} Una evidencia más directa provino de un hallazgo de que la colocación de un gen altamente transcrito en una posición donde no había límite creó un nuevo límite CID en el cromosoma de C. crescentus . ^[148] Sin embargo, no todos los límites CID se correlacionaron con genes altamente transcritos en el cromosoma de E. coli , lo que sugiere que otros factores desconocidos también son responsables de la formación de límites CID y barreras de difusión por superenrollamiento. ^[148]

Macrodominios

Los bucles de ADN plectonémicos organizados como dominios topológicos o CID parecen fusionarse aún más para formar grandes dominios espacialmente distintos llamados macrodominios (MD). En E. coli, los MD se identificaron inicialmente como grandes segmentos del genoma cuyos marcadores de ADN se localizaban juntos (co-localizaban) en estudios de hibridación in situ con fluorescencia (FISH). ^{[151] [152]} Una gran región genómica (~1-Mb) que cubre el locus oriC (origen de la replicación cromosómica) co-localizaba y se llamaba macrodominio Ori. Del mismo modo, una gran región genómica (~1-Mb) que cubre la región terminal de replicación ( ter ) co-localizaba y se llamaba macrodominio Ter. Los MD se identificaron más tarde basándose en la frecuencia con la que los pares de sitios lambda att que se insertaron en varias ubicaciones distantes en el cromosoma se recombinaron entre sí. En este método basado en la recombinación, una MD se definió como una gran región genómica cuyos sitios de ADN pueden recombinarse principalmente entre sí, pero no con aquellos fuera de esa MD. El método basado en la recombinación confirmó las MD de Ori y Ter que se identificaron en los estudios de FISH e identificó dos MD adicionales. ^{[12] [153]}

Los dos MD adicionales se formaron por las regiones adicionales de ~1 Mb que flanqueaban el Ter y se denominaron Izquierda y Derecha. Estos cuatro MD (Ori, Ter, Izquierda y Derecha) componían la mayor parte del genoma, a excepción de dos regiones genómicas que flanqueaban el Ori. Estas dos regiones (NS-L y NS-R) eran más flexibles y no estructuradas en comparación con un MD, ya que los sitios de ADN en ellas se recombinaban con los sitios de ADN ubicados en MD en ambos lados. La posición genética de oriC parece dictar la formación de MD, porque el reposicionamiento de oriC por manipulación genética da como resultado la reorganización de MD. Por ejemplo, las regiones genómicas más cercanas al oriC siempre se comportan como un NS independientemente de la secuencia de ADN y las regiones más alejadas siempre se comportan como MD. ^[154]

La técnica Hi-C confirmó además una organización espacial jerárquica de los CID en forma de macrodominios. ^[126] En otras palabras, los CID de un macrodominio interactuaron físicamente entre sí con mayor frecuencia que con los CID de un macrodominio vecino o con loci genómicos fuera de ese macrodominio. Los datos de Hi-C mostraron que el cromosoma de E. coli se estaba particionando en dos dominios distintos. La región que rodeaba a ter formaba un dominio aislado que se superponía con el MD de Ter previamente identificado. Los contactos ADN-ADN en este dominio ocurrieron solo en el rango de hasta ~280 kb. El resto del cromosoma formó un solo dominio cuyos loci genómicos exhibieron contactos en el rango de >280 kb. ^[126] Si bien la mayoría de los contactos en este dominio estaban restringidos a una distancia máxima de ~500 kb, hubo dos regiones sueltas cuyos loci genómicos formaron contactos a distancias incluso mayores (hasta ~1 Mb). Estas regiones sueltas correspondían a las regiones flexibles y menos estructuradas (NS) identificadas previamente. Los límites del dominio aislado que abarca ter y las dos regiones sueltas identificadas por el método Hi-C segmentaron todo el cromosoma en seis regiones que corresponden a las cuatro MD y dos regiones NS definidas por ensayos basados ​​en recombinación. ^[126]

Proteínas que impulsan la formación de macrodominios

Estera P

Ocupación de MatP y MukB en todo el genoma de E. coli . Disposición circular del genoma de E. coli que muestra la ocupación de MatP y MukB en todo el genoma de E. coli . El círculo más interno representa el genoma de E. coli . Las regiones del genoma que se organizan como dominios espaciales (macrodominios) en el nucleoide se indican como bandas de colores. Los gráficos de histograma de la ocupación del genoma para MatP y MukB según lo determinado por inmunoprecipitación de cromatina acoplada con secuenciación de ADN (ChIP-seq) se muestran en los círculos exteriores. El tamaño de bin de los histogramas es de 300 pb. La figura se preparó en circos/0.69-6 utilizando los datos procesados ​​de ChIP-Seq de. ^[155]

Una búsqueda de proteínas responsables de la formación del macrodominio condujo a la identificación de la proteína Ter del macrodominio (MatP). MatP se une casi exclusivamente en el MD de Ter al reconocer un motivo de 13 pb llamado secuencia ter del macrodominio ( matS ). ^[32] Hay 23 sitios matS presentes en el dominio Ter, en promedio hay un sitio cada 35 kb. Más evidencia de la unión de MatP en el dominio Ter proviene de imágenes de fluorescencia de MatP. Se observaron focos discretos de MatP que se co-localizaron con marcadores de ADN del dominio Ter. ^[32] Un fuerte enriquecimiento de la señal ChIP-Seq en el MD de Ter también corrobora la unión preferencial de MatP a este dominio. ^[32]

MatP condensa el ADN en el dominio Ter porque la falta de MatP aumentó la distancia entre dos marcadores de ADN fluorescentes ubicados a 100 kb de distancia en el dominio Ter. Además, MatP es un jugador crítico en el aislamiento del dominio Ter del resto del cromosoma. ^[126] Promueve los contactos ADN-ADN dentro del dominio Ter pero previene los contactos entre los loci de ADN del dominio Ter y los de las regiones flanqueantes. ¿Cómo condensa MatP el ADN y promueve los contactos ADN-ADN? Los resultados experimentales son contradictorios. MatP puede formar un bucle de ADN entre dos sitios matS in vitro y su actividad de bucle de ADN depende de la tetramerización de MatP. La tetramerización ocurre a través de interacciones de bobina enrollada entre dos moléculas de MatP unidas al ADN. ^[156] Un modelo obvio basado en resultados in vitro es que MatP promueve los contactos ADN-ADN in vivo al unir sitios matS . Sin embargo, aunque MatP conectó sitios distantes en estudios de Hi-C, no conectó específicamente los sitios matS . Además, un mutante de MatP que no pudo formar tetrámeros se comportó como el tipo salvaje. Estos resultados contradicen el modelo de unión de matS para la organización de Ter, lo que deja sin determinar el mecanismo de acción de MatP. Una posibilidad es que MatP se propague a segmentos de ADN cercanos desde su sitio de unión primario de matS y conecte sitios distantes a través de un mecanismo que no depende de la tetramerización. ^[156]

MukBEF

Modelos para la organización del ADN por MatP y MukBEF A. Un modelo de puente matS para la organización del ADN en el macrodominio Ter por MatP. MatP reconoce una secuencia de ADN característica de 13 pb llamada matS que está presente exclusivamente en el macrodominio Ter. Hay 23 sitios matS separados entre sí por un promedio de 35 kb. MatP se une a un sitio matS como un dímero, y la tetramerización de los dímeros unidos al ADN une los sitios matS formando grandes bucles de ADN. B. La arquitectura del complejo MukBEF de E. coli . El complejo está formado por interacciones proteína-proteína entre MukB (azul), MukF (naranja oscuro) y MukE (naranja claro). MukB, que pertenece a la familia de proteínas de mantenimiento estructural de cromosomas (SMC), forma un dímero (los monómeros se muestran en colores azul oscuro y claro) que consiste en un dominio de cabeza de ATPasa y una bobina superenrollada intramolecular de 100 nm de largo con una región de bisagra en el medio. Debido a la flexibilidad de la región bisagra, MukB adopta una forma de V característica de la familia SMC. MukF también tiende a existir como un dímero debido a la fuerte afinidad de dimerización entre monómeros. ^{[157] [158]} El dominio C-terminal de MukF puede interactuar con el dominio de cabeza de MukB mientras que su dominio central puede interactuar con MukE. Dos moléculas de MukE y una molécula de MukF se asocian entre sí independientemente de MukB para formar un complejo trimérico (MukE ₂ F). Dado que MukF tiende a existir en una forma dimérica, la dimerización de MukF da como resultado un complejo hexamérico alargado (MukE ₂ F) ₂ . ^[159] En ausencia de ATP, el complejo (MukE ₂ F) ₂ se une a los dominios de cabeza de MukB a través del dominio C-terminal de MukF para formar un complejo MukBEF simétrico (mostrado a la izquierda). La estequiometría del complejo simétrico es B ₂ (E ₂ F) ₂ . La unión de ATP entre los dominios de cabeza de MukB fuerza el desprendimiento de una molécula de MukF y dos moléculas de MukE. ^{[132] [159]} Como resultado, se forma un complejo asimétrico MukBEF de la estequiometría B ₂ (E ₂ F) _1. Dado que MukF se dimeriza fácilmente, la dimerización de MukF puede unir potencialmente dos moléculas asimétricas unidas a ATP dando como resultado la formación de un dímero de dímeros con la estequiometría de B ₄ (E ₂ F) ₂ (mostrado a la derecha). Se estima que la estequiometría del complejo MukBEF in vivo es B ₄ (E ₂ F) ₂lo que sugiere que un dímero de dímeros es la unidad funcional in vivo . ^[160] C. Un modelo para la extrusión de bucles por un dímero de dímeros de MukBEF. Un dímero de dímeros se carga en el ADN (representado como una línea gris) a través de los dominios de unión al ADN de MukB. Se ha demostrado que MukB se une al ADN a través de su región bisagra y la región superior de su dominio de cabeza. ^{[48] [161]} La translocación del complejo lejos de su sitio de carga luego extruye bucles de ADN. Los bucles se extruyen de manera trepadora mediante la apertura y el cierre coordinados del anillo de MukBEF a través del desacoplamiento de la cabeza de MukB que ocurre debido a la hidrólisis coordinada de ATP en los dos dímeros. ^[160] Los círculos azul oscuro y azul claro representan eventos de unión e hidrólisis de ATP respectivamente. MukE no se muestra en el complejo para simplificar.

MukB pertenece a una familia de ATPasas llamadas proteínas de mantenimiento estructural de cromosomas (SMC), que participan en la organización cromosómica de orden superior en eucariotas. ^[145] Dos monómeros de MukB se asocian a través de una interacción continua de espiral antiparalela que forma una varilla rígida de 100 nm de largo. Una región de bisagra flexible se presenta en el medio de la varilla. ^{[162] [163]} Debido a la flexibilidad de la región de bisagra, MukB adopta una forma de V característica de la familia SMC. Las subunidades no SMC que se asocian con MukB son MukE y MukF. La asociación cierra la formación de V, lo que resulta en grandes estructuras similares a anillos. MukE y MukF se codifican junto con MukB en el mismo operón en E. coli . ^[164] La eliminación de cualquiera de las subunidades da como resultado el mismo fenotipo, lo que sugiere que el complejo MukBEF es la unidad funcional in vivo . ^[160] Las actividades de unión al ADN del complejo residen en la subunidad MukB, mientras que MukE y MukF modulan la actividad de MukB. ^[164]

El complejo MukBEF, junto con Topo IV, es necesario para la decatenación y el reposicionamiento de oriC recién replicados . ^{[165] [166] [167] [168] [155]} El papel de MukBEF no está restringido durante la replicación del ADN. Organiza y condensa el ADN incluso en células no replicantes. ^[131] El reciente mapa de conformación cromosómica de alta resolución de la cepa de E. coli agotada en MukB revela que MukB participa en la formación de interacciones ADN-ADN en todo el cromosoma, excepto en el dominio Ter. ^[126] ¿Cómo se evita que MukB actúe en el dominio Ter? MatP interactúa físicamente con MukB, evitando así que MukB se localice en el dominio Ter. ^[155] Esto es evidente en la unión al ADN de MatP y MukB en el dominio Ter. La unión al ADN de MatP se enriquece en el dominio Ter, mientras que la unión al ADN de MukB se reduce en comparación con el resto del genoma. Además, en una cepa que ya carece de MatP, la ausencia de MukB provoca una reducción en los contactos de ADN en todo el cromosoma, incluido el dominio Ter. ^[126] Este resultado concuerda con la opinión de que MatP desplaza a MukB del dominio Ter. ^[126]

¿Cómo funciona el complejo MukBEF para organizar el cromosoma de E. coli ? Según la visión actual, los complejos SMC organizan los cromosomas extruyendo bucles de ADN. ^[169] Los complejos SMC se translocan a lo largo del ADN para extruir bucles de manera cis (en la misma molécula de ADN), donde el tamaño de los bucles depende de la procesividad del complejo. Los complejos SMC de diferentes organismos difieren en el mecanismo de extrusión de bucles. ^[169] La microscopía de fluorescencia de molécula única de MukBEF en E. coli sugiere que la unidad funcional mínima in vivo es un dímero de dímeros. ^[160] Esta unidad se forma mediante la unión de dos complejos MukBEF unidos a ATP a través de la dimerización mediada por MukF. MukBEF se localiza en la célula como 1-3 grupos que se alargan paralelos al eje largo de la célula. Cada grupo contiene un promedio de ~ 8-10 dímeros de dímeros. Según el modelo actual, el MukBEF extruye bucles de ADN de una manera “escaladora”. ^{[160] [170]} Un dímero de los dímeros libera un segmento de ADN y captura un nuevo segmento de ADN sin disociarse del cromosoma. Además de la formación de bucles de ADN, un vínculo entre el superenrollamiento negativo y la función MukBEF in vivo junto con la capacidad de la subunidad MukB para restringir los superenrollamientos negativos in vitro sugiere que MukBEF organiza el ADN generando superenrollamientos. ^{[171] [172] [173]}

Papel de los NAP y los naRNA

Además de contribuir a la compactación cromosómica doblando, creando puentes y creando bucles en el ADN a una escala menor (~1 kb), las NAP participan en la condensación y organización del ADN al promover contactos ADN-ADN de largo alcance. Dos NAP, Fis y HU, surgieron como los actores clave en la promoción de contactos ADN-ADN de largo alcance que ocurren a lo largo del cromosoma. ^[126] Queda por estudiar cómo las actividades de organización del ADN de Fis y HU que se entienden bien a una escala menor (~1 kb) dan como resultado la formación de interacciones ADN-ADN de largo alcance. No obstante, algunas de las interacciones del ADN mediadas por HU requieren la presencia de naRNA4. ^[86] naRNA4 también participa en la realización de contactos de ADN de largo alcance. HU cataliza algunos de los contactos, no todos, lo que sugiere que el ARN participa con otras NAP en la formación de contactos de ADN. HU también parece actuar junto con MukB para promover interacciones ADN-ADN de largo alcance. Esta visión se basa en observaciones de que la ausencia de HU o MukB causó una reducción en los mismos contactos ADN-ADN. No está claro cómo MukB y HU potencialmente actúan juntos para promover las interacciones ADN-ADN. Es posible que las dos proteínas interactúen físicamente. Alternativamente, mientras MukBEF extruye grandes bucles de ADN, HU condensa y organiza esos bucles. ^{[169] [48]}

Papel de la relación funcional de los genes

Existen informes de que los genes funcionalmente relacionados de E. coli están físicamente juntos en el espacio 3-D dentro del cromosoma a pesar de que están muy separados por la distancia genética. La proximidad espacial de los genes funcionalmente relacionados no solo hace que las funciones biológicas sean más compartimentadas y eficientes, sino que también contribuiría al plegamiento y la organización espacial del nucleoide. Un estudio reciente que utilizó marcadores fluorescentes para la detección de loci de ADN específicos examinó las distancias físicas por pares entre los siete operones de ARNr que están genéticamente separados entre sí (hasta por dos millones de pb). Informó que todos los operones, excepto rrn C, estaban en proximidad física. ^{[174] [175]} Sorprendentemente, los estudios 3C-seq no revelaron la agrupación física de los operones rrn , contradiciendo los resultados del estudio basado en fluorescencia. ^[126] Por lo tanto, se requiere más investigación para resolver estas observaciones contradictorias. En otro ejemplo, GalR, forma una red de interacción de sitios de unión de GalR que están dispersos por todo el cromosoma. ^[176] GalR es un regulador transcripcional del regulón de galactosa compuesto de genes que codifican enzimas para el transporte y metabolismo del azúcar D-galactosa. ^[177] GalR existe solo en uno o dos focos en las células ^[176] y puede autoensamblarse en grandes estructuras ordenadas. ^[178] Por lo tanto, parece que GalR unido al ADN se multimeriza para formar interacciones de larga distancia. ^{[176] [178]}

Forma y estructura global

La microscopía electrónica de transmisión (MET) convencional de células de E. coli fijadas químicamente retrató al nucleoide como un orgánulo de forma irregular. Sin embargo, la obtención de imágenes de fluorescencia de campo amplio de nucleoides vivos en 3D reveló una forma elipsoide discreta. ^{[3] [14] [15]} La superposición de una imagen de contraste de fase de la célula y la imagen fluorescente del nucleoide mostró una yuxtaposición cercana solo en la dimensión radial a lo largo de toda su longitud del nucleoide hasta la periferia celular. Este hallazgo indica un confinamiento radial del nucleoide. ^[13] Un examen detallado de la imagen de fluorescencia 3D después de un corte transversal perpendicular a su eje largo reveló además dos características globales del nucleoide: curvatura y regiones longitudinales de alta densidad. El examen de la quiralidad de la línea central del nucleoide conectando el centro de intensidad de cada sección transversal mostró que la forma general del nucleoide es curva. ^[15] La distribución de la intensidad de fluorescencia en las secciones transversales reveló una subestructura de densidad, que consiste en regiones o haces curvados de alta densidad en el núcleo central y regiones de baja densidad en la periferia. ^{[13] [14]} Una implicación del confinamiento radial es que determina la forma curva del nucleoide. Según un modelo, el nucleoide se ve obligado a doblarse porque está confinado en una célula cilíndrica de E. coli cuyo radio es menor que su longitud flexible (longitud de persistencia). ^[13] Este modelo fue respaldado por observaciones de que la eliminación de la pared celular o la inhibición de la síntesis de la pared celular aumentó el radio de la célula y resultó en un aumento concomitante en el radio helicoidal y una disminución en el paso helicoidal en el nucleoide. ^[13]

Nucleoide como un elipsoide helicoidal con regiones longitudinales de ADN de alta densidad A. Dibujo de una célula de E. coli con un nucleoide curvo (gris oscuro). Una trayectoria de centroides curvos, denotada por puntos rojos y verdes, enfatiza la forma curva del nucleoide ^[13] B. Corte transversal del nucleoide de E. coli visualizado por HU-mCherry. La intensidad de fluorescencia se toma como un indicador de la densidad de ADN y se representa de azul a rojo en orden creciente. ^[14]

Conexiones nucleoide-membrana

Una fuerza de expansión debido a las conexiones entre el ADN y la membrana parece funcionar en oposición a las fuerzas de condensación para mantener un nivel óptimo de condensación del nucleoide. Los estudios de fraccionamiento celular y microscopía electrónica indicaron por primera vez la posibilidad de conexiones entre el ADN y la membrana. ^{[179] [180]} Ahora hay varios ejemplos conocidos de conexiones entre el ADN y la membrana. La transerción es un mecanismo de transcripción, traducción e inserción simultáneas de proteínas de membrana nacientes que forman contactos transitorios entre el ADN y la membrana. ^[181] Se ha demostrado que la transerción de dos proteínas de membrana, LacY y TetA, causa el reposicionamiento de loci cromosómicos hacia la membrana. ^[182] Otro mecanismo de conexiones entre el nucleoide y la membrana es a través de un contacto directo entre los reguladores de transcripción anclados a la membrana y sus sitios diana en el cromosoma. Un ejemplo de este tipo de regulador de transcripción en E. coli es CadC. CadC contiene un dominio sensorial periplásmico y un dominio de unión al ADN citoplasmático. La detección de un entorno ácido por su dominio sensorial periplásmico estimula la actividad de unión al ADN de CadC, que luego activa la transcripción de sus genes diana. ^[183] ​​La localización en la membrana de los genes regulados por un regulador de transcripción anclado a la membrana aún está por demostrarse. No obstante, se espera que la activación de los genes diana en el cromosoma por estos reguladores resulte en un contacto nucleoide-membrana aunque sería un contacto dinámico. Además de estos ejemplos, el cromosoma también está anclado específicamente a la membrana celular a través de la interacción proteína-proteína entre las proteínas unidas al ADN, por ejemplo, SlmA y MatP, y el divisoma . ^{[184] [185]} Dado que los genes que codifican proteínas de membrana están distribuidos por todo el genoma, los contactos dinámicos ADN-membrana a través de la transición pueden actuar como una fuerza de expansión nucleoide. Esta fuerza de expansión funcionaría en oposición a las fuerzas de condensación para mantener un nivel de condensación óptimo. La formación de nucleoides altamente condensados ​​tras la exposición de células de E. coli al cloranfenicol, que bloquea la traducción, respalda la fuerza de expansión de los contactos transitorios entre el ADN y la membrana formados a través de la transerción. ^{[186] [187]} La ​​forma redonda de los nucleoides excesivamente condensados ​​después del tratamiento con cloranfenicol también sugiere un papel de los contactos entre el ADN y la membrana mediados por la transerción en la definición de la forma elipsoide del nucleoide. ^[187]

Visualización

El nucleoide se puede visualizar claramente en una micrografía electrónica a muy alto aumento , donde, aunque su apariencia puede diferir, es claramente visible contra el citosol . ^[188] A veces, incluso son visibles hebras de lo que se piensa que es ADN . Al teñir con la tinción de Feulgen , que tiñe específicamente el ADN, el nucleoide también se puede ver bajo un microscopio óptico . ^[189] Las tinciones intercalantes de ADN DAPI y bromuro de etidio se utilizan ampliamente para la microscopía de fluorescencia de nucleoides. Tiene una forma irregular y se encuentra en células procariotas. ^{[13] [14]}

Daños y reparación del ADN

Se observan cambios en la estructura del nucleoide de bacterias y arqueas después de la exposición a condiciones que dañan el ADN. Los nucleoides de las bacterias Bacillus subtilis y Escherichia coli se vuelven significativamente más compactos después de la irradiación UV. ^{[190] [191]} La formación de la estructura compacta en E. coli requiere la activación de RecA a través de interacciones específicas RecA-ADN. ^[192] La proteína RecA desempeña un papel clave en la reparación recombinacional homóloga del daño del ADN.

De manera similar a B. subtilis y E. coli , las exposiciones de la arquea Haloferax volcanii a tensiones que dañan el ADN causan compactación y reorganización del nucleoide. ^[193] La compactación depende del complejo proteico Mre11-Rad50 que cataliza un paso temprano en la reparación recombinacional homóloga de roturas de doble cadena en el ADN. Se ha propuesto que la compactación del nucleoide es parte de una respuesta al daño del ADN que acelera la recuperación celular al ayudar a las proteínas de reparación del ADN a localizar objetivos y al facilitar la búsqueda de secuencias de ADN intactas durante la recombinación homóloga. ^[193]

Véase también

• Plásmido
• Recombinación homóloga
• Reparación del ADN

Referencias

Este artículo fue adaptado de la siguiente fuente bajo una licencia CC BY 4.0 (2019) (informes de los revisores): Subhash Verma; Zhong Qian; Sankar L Adhya (diciembre de 2019). "Arquitectura del nucleoide de Escherichia coli". PLOS Genetics . 15 (12): e1008456. doi : 10.1371/JOURNAL.PGEN.1008456 . ISSN  1553-7390. PMC  6907758 . PMID  31830036. Wikidata  Q84825966.

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